「国家杰青」马骧领衔！武汉工程大学古双喜/朱园园&华理Nature子刊 | 游离氨基酸的快速对映选择性荧光识别与手性分离！

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氨基酸的对映选择性识别和手性分离在化学、材料科学和生命科学领域具有重要意义。

在本文中，作者报道了一种水溶性手性荧光探针，该探针通过在1, 1'-联-2-萘酚骨架中引入吗啉季铵阳离子，实现了可视化的手性识别与分离。当与游离氨基酸对映体结合时，该探针能在100 s内实现快速手性鉴别，同时伴随着发光颜色或强度的显著变化。

这种手性识别的潜在机制涉及亚胺的形成和静电相互作用，并伴随聚集诱导发光现象。这些过程共同促进了探针与特定氨基酸对映体之间的选择性聚集和沉淀。此外，通过简单的过滤过程，可从D-/L-氨基酸混合物中高效分离出对映体。

利用荧光可视化和手性高效液相色谱进行的对比分析进一步验证了该探针在实现高效手性分离方面的功效。本研究为氨基酸对映体的精确检测和分离提供了一种实用方法。

光学纯氨基酸在揭示生命的基本规律、研发安全有效的药物、推动化学合成发展以及拓展食品营养、工业生物技术等领域的应用中，都发挥着至关重要的作用。因此，氨基酸的对映选择性识别与分离具有重大意义。

目前，科研人员已建立多种用于测定手性氨基酸对映体组成的分析检测技术，包括核磁共振波谱法、紫外-可见吸收光谱法、圆二色光谱法、高效液相色谱法以及荧光/磷光法等。其中，基于荧光强度与波长变化的对映体识别技术，因其灵敏度高、成本低廉且操作简便，受到了越来越多的关注。

迄今为止，各类基于手性分子、超分子组装体和无机纳米材料的荧光探针已被开发出来，用于氨基酸对映体的检测。但这些探针大多对特定对映体的响应时间较长（通常超过30分钟），限制了其更广泛的应用。此外，尽管这类探针在荧光手性识别方面表现出一定效果，但能够实现氨基酸对映体实际手性分离的探针却寥寥无几。

对映体分离是获取具有可靠立体化学完整性的高光学纯氨基酸的主要方法之一。目前已建立的分离策略包括色谱技术、膜分离技术以及选择性结晶与沉淀法等。其中，选择性沉淀法是实现氨基酸大规模对映体分离最简单、最具成本效益的方法。若将手性荧光探针作为手性选择剂引入体系，使其与外消旋氨基酸混合物中的单一对映体特异性结合并发生结晶或沉淀，那么就可利用荧光实现手性分离过程的可视化。该方法有望大幅简化手性分离的操作流程，同时提高整体分离效率。

此外，鉴于氨基酸水溶性良好而脂溶性较低的特性，在纯水相中进行手性分析与分离具有显著优势。近期，作者团队及其他研究小组报道了一些荧光探针，它们可通过荧光强度或波长的变化，识别水溶液中的游离氨基酸对映体。然而，设计能与特定氨基酸对映体选择性聚集并沉淀的荧光探针面临着巨大挑战，因此目前关于利用荧光法在水相介质中同时实现氨基酸对映选择性检测与分离的报道仍然十分有限。

综上，作者通过合理设计，在基于1, 1'-联-2-萘酚（BINOL）的手性醛的2'位引入含吗啉的季铵离子基团，合成了一种阳离子型手性荧光探针(S)/(R)-Y3。这种修饰不仅增强了探针的水溶性，还促进了其与氨基酸之间的静电相互作用。该荧光探针（S）/(R)-Y3可借助荧光强度的显著差异，在100 s内实现对D/L-甲硫氨酸（Met）的快速检测。

此外，当探针与锌离子及甲硫氨酸的特定对映体结合后，会因聚集诱导发光（AIE）效应产生发光颜色与强度的变化，从而实现手性识别过程的动态可视化。作者结合圆二色光谱、扫描电子显微镜、密度泛函理论（DFT）计算、核磁共振波谱及质谱等多种手段，阐明了手性识别与高对映选择性的作用机制。

进一步研究表明，基于发光强度与颜色的差异，该探针成功区分了17种游离氨基酸的对映体对，响应时间可短至数十秒，使其成为已报道的发光手性识别研究中最高效的方法之一。

值得注意的是，探针与单一氨基酸对映体的相互作用会诱导聚集并发生沉淀，通过简单的过滤即可实现对映体的分离，且整个过程可通过荧光进行追踪。与手性高效液相色谱的结果对比证实，该探针具备优异的手性氨基酸分离能力。

这种集检测与分离于一体的策略，不仅能提供即时的可视化荧光信号，还可通过简单的过滤操作直接分离出高光学纯的单一对映体。本研究实现了在数分钟内从外消旋混合物中分离出纯氨基酸对映体，通过荧光探针策略达成了快速高效的分离目标。

图1：构建用于游离氨基酸对映选择性识别与手性分离的荧光分子。a）通过整合醛基与吗啉阳离子片段设计的荧光分子，可优化手性识别位点并产生静电聚集，实现共价与静电作用的协同。b）(S)-Y3分子借助聚集诱导发光（AIE）效应，能在水溶液中快速区分D型与L型氨基酸（识别时间<100 s），在手性可视化识别与分离方面具备多项优势。c）对氨基酸的发光手性传感技术（手性识别比至少为3）进行综述，结果显示本方法在传感速度与适用底物范围上优于所有已报道的方法。d）手性荧光探针(S)-Y3对氨基酸的对映选择性识别与分离示意图，配有可见光下聚集沉淀物的照片。AAs 代表氨基酸，AIE 代表聚集诱导发光。

图2：对映选择性识别的光学性质。a）(S)/(R)-Y3及D/L-蛋氨酸（Met）的分子结构。b）紫外-可见吸收光谱、c）圆二色谱（CD）：测试体系为水溶液中的(S)/(R)-Y3、(S)/(R)-Y3 + Zn²⁺、(S)/(R)-Y3 + Zn²⁺ + D-/L-蛋氨酸（Met），浓度33 μmol/L，pH 8.8。d）(S)-Y3、(S)-Y3 + Zn²⁺、(S)-Y3 + Zn²⁺ + D-/L-蛋氨酸（Met）的荧光光谱：测试条件为水溶液浓度33 μmol/L，pH 8.8，激发波长420 nm。e）(R)-Y3、(R)-Y3 + Zn²⁺、(R)-Y3 + Zn²⁺ + D-/L-蛋氨酸（Met）的荧光光谱：测试条件为水溶液浓度33 μmol/L，pH 8.8，激发波长420 nm。f）水溶液中(S)/(R)-Y3、(S)/(R)-Y3 + Zn²⁺、（(S)/(R)-Y3+ Zn²⁺ + D-/L-蛋氨酸（Met）的荧光量子产率（pH 8.8）。g）特定反应时间后，365 nm紫外光照射下，(S)-Y3 + Zn²⁺与D-蛋氨酸（Met）、L-蛋氨酸（Met）作用时的发光颜色变化可视化图。h）(S)-Y3 + Zn²⁺与D-蛋氨酸（Met）、L-蛋氨酸（Met）反应后不同时间点的荧光强度。i）不同乙腈-水体积比混合溶剂中，(S)-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）的荧光光谱。j）i中不同乙腈-水体积比下(S)-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）的荧光强度。k）530 nm处荧光强度的柱状图：测试体系为不同pH缓冲液中的(S)-Y3（浓度33 μmol/L，1当量） + Zn²⁺（水溶液，2当量）与不同pH缓冲液溶解的L-/D-蛋氨酸（Met，25当量）的反应体系；蓝色曲线为荧光量子产率（ef）值随pH的变化曲线（激发波长λ_exc=420 nm；狭缝宽度3/3 nm；静置时间15 min）。

图3：选择性聚集与手性识别的表征。a）自然光下，不同作用时间点（S）-Y3 + Zn²⁺溶液与D-蛋氨酸（Met）、L-蛋氨酸（Met）作用后的颜色及状态变化可视化图。b）(S)-Y3（浓度99 μM，1当量） + Zn²⁺（2当量） + L-蛋氨酸（Met，25当量）水溶液及其滤液在自然光和365 nm紫外光照射下的可视化图像；同时包含(S)-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）体系及其滤液的荧光光谱。c）(S)-Y3（浓度0.67 mmol/L，1当量） + Zn²⁺（2当量）分别与L-蛋氨酸（Met，25当量）、D-蛋氨酸（Met，25当量）作用后混合物的扫描电子显微镜（SEM）图像及能谱分析（EDS）结果。d）(S)-Y3（浓度0.95 mmol/L）、(S)-Y3（浓度0.95 mmol/L，1当量） + Zn²⁺（2当量）、（S）-Y3（浓度0.95 mmol/L，1当量） + Zn²⁺（2当量） + L-蛋氨酸（Met，25当量）、（S）-Y3（浓度0.95 mmol/L，1当量） + Zn²⁺（2当量） + D-蛋氨酸（Met，25当量）体系的氢核磁共振（¹H NMR）谱图；实验中乙酸锌（Zn(OAc)₂）溶于重水（D₂O），（S）-Y3、L-蛋氨酸（Met）及D-蛋氨酸（Met）溶于重水（D₂O）配制的pH 8.8 BICINE缓冲液；（S）-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）混合体系中的聚集体经滤出后，溶于氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆）进行氢核磁共振（¹H NMR）测试。e）（S）-Y3（溶于pH 8.8 BICINE缓冲液，浓度33 μmol/L，1当量）与L-蛋氨酸（Met，溶于pH 8.8 BICINE缓冲液，25当量）、乙酸锌（Zn(OAc)₂，溶于水，2当量）反应混合物的高分辨质谱（HR-MS）图；实验中沉淀物溶于甲醇（MeOH）后进行测试。

图4：荧光传感与手性识别机理。a）（S）-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）、（S）-Y3 + Zn²⁺ + D-蛋氨酸（Met）体系的独立梯度模型（氢键）（IGMH）等值面及分子结构。b）在M06-2×/6-31 G(d,p)计算水平下，2[(S)-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）]体系的静电势（ESP）计算分布。c）（S）-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）、（S）-Y3 + Zn²⁺ + D-蛋氨酸（Met）体系的推测及建模结构；图中给出了与对映体对形成的配合物之间的能量差，单位为kcal/mol（计算细节详见支持信息）。d）（S）-Y3 + Zn²⁺ + L-蛋氨酸（Met）、（S）-Y3 + Zn²⁺ + D-蛋氨酸（Met）体系基态（S₀）与第一激发态（S₁）的几何构型对比图及对应的均方根偏差（RMSD）值（基态（S₀）结构以红色表示，第一激发态（S₁）结构以蓝色表示）。

图5：一种用于检测手性游离氨基酸的快速荧光方法。a）用于在水溶液中检测19种手性氨基酸的荧光探针（S）-Y3的化学结构。b）按不同结构类别分组的手性氨基酸的荧光增强比；谷氨酰胺（Gln）与组氨酸（His）因具有独特的荧光性质，用特殊颜色标注。c）受试手性氨基酸的化学结构，以及相同实验条件下（pH 8.8）使用（S）-Y3探针对各氨基酸检测时，肉眼可见的荧光强度与颜色差异照片。

图6：手性分离分析与荧光可视化。a）探针（S）/（R）-Y3用于D/L-氨基酸手性分离及荧光可视化的示意图。b）50%对映体过量（ee）蛋氨酸（Met）、c）0%对映体过量蛋氨酸、d）-50%对映体过量蛋氨酸的氨基酸混合物，在加入（S）/（R）-Y3探针与Zn²⁺后过滤前后的荧光光谱（探针浓度：0.20 mM，蛋氨酸：25当量，Zn²⁺：2当量，激发波长λ_exc = 420 nm，狭缝宽度：3/3 nm）；插图为不同对映体过量值（50% ee蛋氨酸、0% ee蛋氨酸、-50% ee蛋氨酸）的氨基酸混合物，在加入（S）/（R）-Y3探针与Zn²⁺后，于自然光和365 nm紫外光下的可视化图像。（S）/（R）-Y3探针与手性氨基酸混合物作用形成沉淀物，经解离后得到的高效液相色谱（HPLC）谱图：e）50% ee蛋氨酸、0% ee蛋氨酸、-50% ee蛋氨酸；f）70% ee苯丙氨酸（Phe）、60% ee苯丙氨酸、-70% ee苯丙氨酸；g）80% ee亮氨酸（Leu）、-80% ee亮氨酸。高效液相色谱测试条件：手性色谱柱为CHIRALPAK ZWIX(−)，规格4.0 mm × 150 mm × 3 μm；蛋氨酸与苯丙氨酸的流动相为甲醇（含50 mM甲酸和25 mM二乙胺）；亮氨酸的流动相为甲醇（含50 mM甲酸和25 mM二乙胺）/乙腈=60/40。

综上，作者开发了一种基于水溶性手性荧光探针的快速手性识别和分离技术，通过将吗啉基季铵阳离子引入1, 1'-联萘酚框架，实现了对游离氨基酸对映异构体的快速视觉识别和分离。

该探针能够在100 s内通过荧光强度或波长的变化实现对17种游离氨基酸对映异构体的快速区分，并通过简单的过滤过程实现高效分离。研究还通过DFT计算揭示了其手性识别机制，包括亚胺键形成和静电相互作用。

本研究提供了一种快速、高效且低成本的手性氨基酸识别和分离方法，解决了传统荧光探针响应时间长和分离效率低的问题，为手性化学和生物分析提供了新的工具。

这种荧光探针技术可用于生物医学研究中的手性药物开发、食品科学中的营养分析以及工业生物技术中的手性化合物纯化等领域，具有广泛的应用潜力。

Rapid enantioselective fluorescence recognition and chiral separation of free amino acids. Nat. Commun., (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-025-68144-y.

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