但凡在实验室待过的人儿都知道HPLC是液相色谱，使用的仪器是高效液相仪，MS是质谱法，但您真的了解吗？出现问题，您轻松解决了吗？不了解也没关系，今天跟着小微一起来学习咯！
一、什么是液相色谱法
Ø定义：液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。
Ø由来：1906年俄国植物学家茨维特（M.S.Tswett）将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带，每个色带代表不同的色素。
ØHPLC定义：HPLC是High Performance Liquid Chromatography的缩写，指高性能液相色谱的意思。
二、HPLC系统构成
ØHPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。此外，还可根据需要配置梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
Ø简易图：
三、系统装置
1、输液系统
Ø输液泵按照输出液恒定的因素分为恒压泵和恒流泵，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
Ø输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
Ø满足输液泵应具备以下条件：
①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；
②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；
③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
2、脱气装置
Ø原因：
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。
Ø措施：液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。
3、梯度洗脱装置
ØHPLC有等度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。
①等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。
②梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。
4、进样系统
Ø一般HPLC分析常用六通进样阀，六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
5、分离系统
Ø分离系统包括色谱柱、保护柱以及柱温箱。
6、检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置，是HPLC仪的三大关键部件之一。
7、数据处理系统
对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
四、质谱（MS）
MS质谱分析，MS质谱分析，指的是所有通过获得质谱图的方法来进行化合物分析鉴定的一类分析方法。质谱分析的原理是将先将样品离子化，根据不同离子的质荷比不同对离子进行分离并检测离子的相对分子质量。
五、示例及运用
1、仪器：
2、检测内容：
①可测氨基酸含量，单糖组成、核苷酸、有机酸、生物胺、维生素、吲哚类、半胱亚磺酸定量，可打一级和二级质谱。
②游离氨基酸24 种+1种氨基丁酸（需指定），酸解氨基酸 17 种，碱解色氨酸，也可测牛磺酸。
③有机酸可测乳酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸（琥珀酸）这 4 种。
④可测核苷酸样品。
⑤可测生物胺样品。
⑥可测维生素成分等。
3、数据图谱
Ø氨基酸检测图
Ø单糖HPLC检测图
Ø核苷酸检测图
Ø有机酸检测图
Ø标品
PS：我司拥有140种多酚标品，该检测项目技术成熟。
五、常见问题
Q1:峰面积差异很大，忽高忽低，这是为什么?
如：使用同一台仪器检测同个样品，连续进6针，峰面积差异很大，忽高忽低，这是为什么?
A：①进样器有的时候会出现气泡，如果此时连续进一个样品就会出现峰面积忽高忽低，多做几次purge injector就OK了。
②用标准品试一下看是不是样品的问题;然后再看看柱压柱温、流速、进样器、氘灯有没有问题。
③查看定量环是否有气泡
④进样的六通阀、色谱柱接口、泵至色谱柱接口的管路中是否有泄漏现象
总结：遇见此类问题，要么是样品的原因，要么是仪器原因。如果是样品，建议换一下其他样品试一下;如果是仪器原因，可能是进样器、定量环、比例阀等等问题。
Q2:新柱（如C18柱）怎样进行活化及维护？为什么要这样做？
A：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。
Q3:为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash？
A：HPLC用缓冲盐时，由于泵头内的缓冲盐溶液存在盐析现象，析出的细小盐粒非常坚硬，它附着在柱塞杆上，柱塞杆往复运动时，容易产生划痕，并磨损密封垫，造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。
PS:缓冲盐的浓度在0.1M或大于0.1M时，必须使用该在线冲洗选项。
清洗液配制: 90%水+10%异丙醇。该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。
Q4:如何防止溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？
A：溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH = 4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
①请严格执行溶剂过滤。
②请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液。
③若应用许可，可在溶剂中加入5%甲醇。
④在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹惰性气体如氮气，以隔绝空气。
⑤避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用棕色的溶剂瓶装水溶液或磷酸盐缓冲液。
Q5:基线不稳：如基线出现波动或漂移。
A：可能原因：
①仪器内部污染。
②流动相或样品中存在气泡。
③离子源污染或老化。
措施：可通过清洗仪器、排除气泡、更换离子源。
Q6:溶剂应该如何保存？
A：棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。避免使用可腐蚀钢铁溶剂如:碘化锂、氯化钾等；高浓度无机酸：如硝酸、硫酸等。
Q7:质谱图异常：如质谱图中出现异常的峰或噪声
A：可能原因：
①样品中存在未知干扰物质。
②质谱仪参数设置不当。
③数据处理软件问题。
措施：深入分析样品成分和性质；调整质谱分辨率、扫描范围等参数；检测当前使用的数据处理软件运行是否正常。