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【晶云·分享】粒度分析在晶型研究中的应用

晶云药物

2023-01-03

本系列文章是由晶云固态检测中心整理发起的交流学习专栏，旨在与业界同行探讨及分享各类固态表征的系统应用，挖掘及研究各类测试的结果及数据意义，交流及解决表征测试中遇到的各类问题，期待为药物结晶研发过程中遇到的问题提供解决思路。

内容导览

1. 引言

2. 激光粒度散射仪的应用

2.1 激光衍射法

2.2 湿法/干法的特点

3. 粒度分布方法开发

3.1 湿法方法开发

3.2 干法方法开发

3.3 分析方法验证

4. 测试注意事项

5. 结语

引言

药物研发过程中，原辅料的粒径分布可能会对终产品的性能产生显著的影响（如：溶解度、生物利用度、含量均匀度、稳定性等），最终可能影响药物的安全性、有效性和质量。在原料药和药物制剂的质量控制准中，粒度分布（Particle Size Distribution, PSD）已经成为一项重要的检测项目。

粒度分布是用一定方法反映出一系列不同粒径区间颗粒分别占颗粒总量的百分比，常用的测定方法有显微镜法、筛分法、沉降法、离心法、动态光散射和激光衍射法等，其中激光衍射法因快速、方便和样品用量小等优点，成为一种常用的粒度分布测定方法。

激光衍射粒度分析仪的应用

2.1 激光衍射法

❖

激光衍射法测粒度分布原理

激光衍射粒度分析仪测试样品粒度分布，其原理是单色光束照射到颗粒供试品后即发生散射现象。由于散射光的能量分布与颗粒的大小有关，通过测量散射光的能量分布（散射角），依据米氏散射理论和弗朗霍夫近似理论，即可计算出颗粒的粒度分布，测量范围可达0.02～3500μm。

❖

粒度分布

等效圆球粒径是假通过测量样品颗粒的某种特征，以具有相同特征的球体直径表征它的大小。需要注意的是，不同的粒径测试方法得到的粒径结果可能是不同的等效圆球直径，如体积等效圆球、重量等效圆球、表面积等效圆球等。

粒度分布图，理想状态是一个正态分布曲线，X轴（水平轴）代表各个粒径，y轴对应含量的百分比。粒度分布图越接近正态分布，粒度分布越均匀，使用性越好。

粒度分布的特征值最常用的是累积分布值，Dv10，Dv50， Dv90，其中Dv50也是中值。另外，结合样品颗粒的特性，表面积平均值D[3，2]以及体积平均值 D[4，3]也可作为粒度分布的特征值。

2.2 湿法/干法的特点

根据分散介质的不同，粒度分布测试方式可分为湿法测试（分散介质为液体）和干法测试（分散介质为气体），需要结合样品的理化性质，选择合适的PSD测试方法。

湿法测试&干法测试

湿法测试是将样品分散于合适的介质中，适用于测定混悬或者不溶于分散介质的样品；

干法测试是将样品采用压缩空气分散，其分散效果与压力设置直接相关，适用于测定水溶性或者无合适分散介质的样品。

粒度分布方法开发

3.1 湿法方法开发

湿法测试的方法开发，需要关注以下问题。

取样代表性

取样代表性是保证测试重现性的前提，所取样品必须能够代表整个样品，尤其对于大颗粒（＞70μm）样品。若取样不具有代表性，测量偏差可能达20%。

分散介质的选择

合适的分散介质是湿法的关键，对于分散介质的选择，需要考虑多重因素：

透明且黏度适合，方便后续搅拌和观察
不能与被测物发生化学反应
溶解度低或不溶，无溶胀现象
与被测物的折射率相近
浸润被测物且不结块
不易产生气泡

根据极性不同，可将分散介质分为5类。长链烷烃类有十二烷、矿物油、葵花籽油、棕榈油等；烷烃类有正己烷、正庚烷、异辛烷和环己烷；醇类有甲醇、乙醇和异丙醇；有机酸有乙酸；最常用的是水，透明、经济且环保，而且水可以避免有机溶剂的温度梯度对于测量的影响。

添加剂的选择

为了降低表面张力，浸润样品，必要时添加少量的表面活性剂。表面活性剂的选择取决于颗粒表面化学性质和分散介质的性质，常用的非离子表面活性剂有吐温、司盘；阳离子表面活性剂有SDS；阴离子表面活性剂有CTAB。

为避免分散后的样品再次团聚、沉淀、凝聚，有时需要加入少量的分散剂，通过静电稳定、空间位阻和静电位阻等方式助分散，如六偏磷酸钠、柠檬酸铵和焦磷酸钠。

测量条件设置

湿法测试中的测量条件主要包含泵/搅拌器的转速、样品的浓度和超声处理。

泵/搅拌器的转速

泵/搅拌器的转速可以通过测量值的粒径变化随泵/搅拌器转速变化情况来确定，一般来说，合适的转速，可使样品均匀、连续的进入样品检测池，测量结果有较好的重复性。

在低转速时，样品中的大颗粒未悬浮，可能导致粒径结果偏低；提高转速，使颗粒保持良好的悬浮，测量的粒度达到平稳值，其中粒度保持恒定。此时，粒径测量结果与真实值接近。但需要注意的是，高转速可能导致分散剂产生气泡，也可能导致大颗粒被打碎，特别是对于乳状样品。

样品浓度

样品浓度主要根据遮光度确定，样品浓度过低，取样代表性不足或者信噪比差；样品浓度太高，产生多重衍射现象，导致测量结果偏低。

对于小颗粒样品（粒径小于10μm），样品浓度应使遮光度小于10%；对于大颗粒样品，样品浓度应使遮光度达到 8%~20%。

超声处理

对于固体颗粒，可采用超声处理方式分散样品。根据测量值的粒径变化随超声时间或者超声强度变化情况来确定超声参数。需要注意的是，如果样品刚刚润湿后，遮光度迅速降低，说明被测物质可能溶解于分散剂中，需更换合适的分散剂；随着超声处理时间的增加，粒度仍然持续减少，表明颗粒可能因超声破碎。对于乳剂测试，则不需要超声处理，否则会促进进一步乳化。

3.2 干法方法开发

干法测试方法开发要点有样品性质、取样代表性以及测量条件设置。

样品性质

适用于干法测试样品性质：易通过气流分散，样品的脆性适当、不易被打碎，无毒。

取样代表性

与湿法测试一样，取样代表性同样是保证测试重现性的前提。

测量条件设置

干法测试中的测量条件主要包含分散压力、文丘里管类型和进样速度。

分散压力

分散气流压力可以通过测量值的粒径变化随分散气流压力变化情况来确定，从高压到低压，筛选出粒径的平台压力。颗粒分散的容易程度取决于颗粒尺寸，因为随着颗粒尺寸的减小，颗粒之间的相对粘附力增加。一般情况下，小颗粒样品（粒径小于10μm），团聚能越大，难于分散，而大颗粒样品（粒径大于10μm），团聚能越小，较易分散。

文丘里管类型

文丘里管类型根据样品特性选择。易碎的样品选择标准文丘里管（Standard Venturi）；小颗粒，尤其是粉碎后样品（极易粘结和团聚）则选择高能量文丘里管（High energy Venturi），增加碰撞机会，增加分散机会。

进样速度

样品的进样速度通过进样振动速度、进样盘的类型和遮光度设置（遮光度过滤）调节。优化进样速度，保持连续稳定的样品流动，并使遮光度稳定在合适的范围内。遮光度太低，信噪比不足；遮光度太高，会减弱分散效果，可能带来假峰。小颗粒样品的遮光度范围一般在0.5%~3%之间，其他样品的遮光度范围在0.5%~6%之间。

3.3 分析方法验证

相对于其他分析方法的验证，激光衍射粒径分布测定法的验证内容较少，主要包括耐用性和精密度（重复性和中间精密度），其中干法测试与湿法测试的耐用性内容有所区别。各项法规中，USP<429>、EP 2.9.13、中国药典2020以及ISO133320:2020对方法精密度的验证，相对标准偏差RSD需要符合要求。

测试注意事项

注意事项

结合晶云过去12年的药物固态研究经验，对PSD测试中的注意事项进行如下总结与分享。

1 样品固态性质

样品粒径测试结果受到多种因素影响，除仪器方法外，样品本身固态性质也将影响样品测试结果。

实际测试的样品颗粒大小几乎不会完全一致，故样品中大/小颗粒能否混合均匀，将直接决定实验人员的取样、加样代表性。若混合不均匀，大颗粒易沉于瓶底，仅取上层颗粒进行测试，测试结果与实际情况将存在明显差异。如果样品的粒径分布越宽，取样代表性的难度就越大。

另一种情况，如果样品中大颗粒多来自团聚，在没有较好减弱样品团聚现象的情况下，每次测试均采集到未分散好的中间状态，测试结果的重复性会受到影响。

2 观察测试过程

在测试过程中，通过观察判断取样状态，判断样品是否具有代表性。测试前，需观察样品颗粒是否有明显团聚、结块、大小不均一的现象；分散介质预分散样品时，进一步观察大颗粒是否沉底；加样过程中，应多次冲洗样品瓶，确保大颗粒加入进样器。

除了取样，合适的分散介质以及能否使样品较好地分散，也是影响测试结果的重要因素。预分散样品时，可观察分散介质的分散效果。

左：易起泡，测试时会将气泡作为样品颗粒带入计算，影响结果

中：颗粒沉底，分散效果较差

右：颗粒分散较好，无明显沉底、气泡、不浸润等现象

3 不同粒径测试方法比较

药典粒度测试方法有显微镜法、筛分法及光散射法，但是不同方法测得粒径结果通常无法直接比较。激光粒度仪是将样品颗粒拟合为等体积的球形，再计算球形的直径得出粒度分布结果。实际样品几乎不可能是球形，仪器将根据数学模型进行拟合计算。显微镜法是在一定比例视野范围内，目视计算颗粒数占比。筛分法是根据筛网孔径，筛分不同粒径范围的颗粒，计算目标范围内颗粒重量比。

由此，不同方法的原理和计算公式存在明显区别，这将导致不同方法的粒径数据存在差异。在比较样品粒径时，需保持方法一致。

4 湿法-干法的选择

样品首次PSD测试，初步考察样品在短时间内不溶于分散介质，优先推荐湿法测试。样品团聚是常见现象，湿法可用分散介质辅助分散，并通过超声进一步分散，通常可达到较好的分散效果，避免团聚带来的影响，适合首次快速测试样品。

需要注意的是，如果分散介质无法使颗粒较好地分散，超声后可能使样品颗粒团聚。此种情况下，超声前的数据也不能代表样品颗粒真实粒径，需要开发合适的PSD方法分析该样品。

5 PLM与PSD联用

PSD作为粒径表征手段，可与多种技术联用，共同表征样品颗粒性质。例如，与PLM联用，PLM可以直观地显示样品大概的形貌、颗粒大小以及是否有团聚的现象，辅助PSD的表征。如下图所示，PLM显示样品颗粒存在明显团聚现象；结合PSD结果，超声后的样品粒径减小，是由于超声减弱团聚的作用导致的。样品超声后的测试结果更接近样品真实状态。

结语

药物多晶型研究贯穿于原料药研究、制剂研究各个阶段。粒度分析是晶型研究不可或缺的表征手段，晶云配有多台PSD仪器（Mastersizer 3000、Microtrac S3500），期待为各位伙伴提供快速精准的PSD表征，以及方法开发验证工作，助力晶型药物的研发。

请大家关注后续系列文章，共同分享探讨。

关于晶云

苏州晶云药物科技股份有限公司创立于2010年，致力于建立全球领先的晶型研发，制剂开发和生产服务平台，帮助创新药公司加速从临床前候选化合物到上市药物的转化。晶云药物总部位于苏州工业园区生物医药产业园，在美国新泽西州和加拿大多伦多设有分部。

晶云药物以药物晶型研究为核心纵深发展，在新药CMC领域，致力于帮助全球制药公司研发高质量的新药，加速新药研发进程，提早在中美等地区提交新药申请并上市。晶云团队凭借专业高质的服务和快速高效的响应，已与全球超过800家制药企业建立合作，为超过1,500个新药化合物提供了药物晶型研发的专业技术解决方案。

作为全球制药企业国际化及创新药研发的可靠合作伙伴，晶云将一如既往地秉承极致和创新的精神、质量和时间优先、与客户共赢合作共同发展的理念，力求为越来越多的制药公司提供优质高效的药物固态研发，制剂开发和生产解决方案，帮助其降低临床开发风险，缩短研发周期，提高药物申报通过率并建立全面的专利保护壁垒。

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