一例荧光定量PCR仪核酸污染清除的案例分析

8月初，我们收到客户的反馈，经常出现弱阳性的检测结果（Ct值：32-38），经复测后为阴性，且猪只无临床表型。同时反馈阴性对照异常， Ct值从最开始的37-38，逐渐降至30-32。初步判断实验室存在污染，且污染在逐渐的加重。

图1 客户实验室示意图

对实验室的操作台面、移液器、荧光定量PCR仪进行检测，发现污染源主要来自于荧光定量PCR仪（Ct为13.81），检测结果见表1和图1。且实验人员反馈8联管质量较差，常遇到PCR反应结束后PCR管盖翘起的现象。

表1 实验室污染源的检测

图2 实验室污染源检测扩增曲线

（一）仪器核酸污染清除的难点

常用于PCR实验室的消毒剂有含氯类（如84消毒液、次氯酸、二氧化氯）、过硫酸氢钾类（如卫可）和商用核酸清除剂。含氯类和过硫酸氢钾类对于仪器金属部件具有腐蚀性，因此并不适合用该类消毒剂对荧光PCR这种紧密仪器消毒。

（二）仪器核酸污染清除采取措施

（1）由于仪器外部喷有涂漆，针对于本次仪器外部有高浓度的病毒含量（Ct值约为26），用含30%的84消毒液打湿无尘毛巾进行反复的擦拭，仪器内部用75%的酒精打湿拧干后进行初步的灰尘和污染的清除；

（2）将摆放的仪器至于一个开阔的空间，使用风扇进行强通风，清除核酸气溶胶污染。

图3 仪器污染清除

经过长达半个月的擦拭和强通风处理，仪器核酸污染浓度逐步降低，检测结果见图3（因该PCR仪受到高浓度核酸污染，通过长期清洁降低了核酸浓度，但依然不能完全清除，后续实验使用质量较好的八连管可避免因仪器轻微污染而对结果造成影响）。 

图4 荧光定量PCR仪消毒清洁后检测结果

注：纵坐标表示检测Ct值，横坐标表示消毒清洁天数，Ct值为45表示未检出。

如何防范实验室荧光定量PCR仪核酸污染？

若未遵守PCR检测实验室规范，实验室污染是荧光定量PCR操作过程中很容易出现的一种情况。其中荧光定量PCR仪的污染主要源于8联管的使用不当，防止荧光定量PCR仪的污染包括

（1）上机前，再次确认8联管是否盖紧；

（2）选用经验证的密封性、透光性好的8联管；

（3）在上机程序中，扩增程序完成后，加入仪器冷却的步骤；

（4）严禁打开PCR扩增产物管盖，以防气溶胶的污染；

（5）及时丢弃使用完的8联管。

实验室核酸污染是荧光定量PCR技术中较常见的情况，标准的实验室分区、良好实验室操作习惯、执行到位的日常卫生清洁、有效的实验室管理、品质较佳的实验用品（设备、试剂盒、耗材）是保证实验结果正常不可缺少的环节。 可采取措施有：

• 选用带内参的PCR试剂，通过内参监控每个反应，减少做阳性对照；

• 人员和样本单向流动；

• 不同区域实验服用不同颜色区分，防止混用；

• 不同区域移液器标识区分，防止混用；

• 实验完成后使用84消毒液擦拭地面、台面及移液器等（不同区域拖布

和抹布不要混用）；

• 实验完成后使用紫外消毒车0.5米左右照射台面30min。