基于类黄酮成分的不同品种无花果采收时机及抑癌活性研究- 大数跨境

天然产物研究与开发

2021-10-16

导读：本文研究了不同品种以及采收期的无花果叶类黄酮对癌细胞的增殖抑制效应，并阐明其抑癌机理。

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无花果(Ficus carica L.)属于桑科榕属温带落叶果树，原产于幼发拉底河和底格里斯河流域，是人类驯化最早的栽培果树之一，距今已有1万年以上种植历史。类黄酮类化合物被证实是一种潜在的天然抗氧化剂，具有抑菌、抗肿瘤等作用。无花果的根、茎、叶、果均可入药。20世纪50年代Ull-man提出，外用无花果乳汁处理动物肠道，能引起大量的毛细血损伤，严重时导致动物死亡; 但若经口服，则没有任何毒性。从无花果乳汁中分离出4种活性组分，其中2种组分经皮下注射或者静脉注射，能抑制小鼠移植性肉瘤生长。后续证实，无花果乳汁液能显著抑制小鼠原发性乳腺癌细胞生长，导致癌细胞坏死，延缓移植性腺癌、骨髓性白血病、淋巴肉瘤和肉瘤发生，并引起肉瘤退化。在中国，Wang等首先报道无花果根、茎、叶和果实(包括幼果和成熟果) 提取液对S180肉瘤、肺癌、肝癌和艾氏腹水癌均具有明显的抑制活性。他们将无花果水提液供给荷瘤小鼠或癌症病患，均能提高试验对象的免疫功能，因而建议，无花果制剂可以作为一种天然、无毒的辅助性药物，以缓解化疗、放疗患者病痛，提高生活质量。然而，无花果抗癌有效成分却一直未阐明。Takeuchi等最早提出，苯甲醛是无花果抗癌的主要成分。Yin等认为，无花果抗癌是包括香豆素类化合物、苯甲醛和呋喃环类小分子芳环化合物共同作用的结果，苯甲醛只是增效剂或有机活性分子之一。后来发现，无花果多糖具有抗癌活性。但是，多糖物质结构复杂，其与抗肿瘤的关系需要更多探讨。另一方面，类黄酮与抗癌的关系引起大家重视。Sharada等提出，无花果中含有的一种类黄酮物质桑色素(morin) 可以抑制1,2-二甲基肼(DMH)诱发的大鼠结肠癌发生。有关这一研究缺乏后续报道。介于无花果品种众多，不同时期成熟的果实叶片可能具有不同功能。为此，本研究于2019年7月至11月间，采集3个无花果品种叶片，分别提取并精制类黄酮，研究不同月份品种叶片对人体癌细胞增殖的抑制活性，探讨无花果类黄酮的抑癌机理，分析类黄酮物质与抗癌活性的关系，以期为无花果类黄酮在抗癌医药上的应用开发提供理论依据。

类黄酮是两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，具有C6-C3-C6结构，难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。因此，无花果醇类提取液，甚至无花果酒中都含有一定量的类黄酮，并且具有抑癌活性。在抗肿瘤方面，Bai等利用无花果乙醇提取物腹腔注射荷S180实体瘤小鼠，发现对肉瘤生长有明显的抑制作用，并增加脏器指数，增强T淋巴细胞百分数，暗示着无花果乙醇提物可能通过增强荷瘤小鼠免疫功能起到抗肿瘤效果。这是无花果类黄酮抑制动物肿瘤的最早报道。本试验中，我们观察到无花果叶片类黄酮对人体胃癌细胞SGC-7901细胞增殖有显著抑制活性，但是，对胃癌BGC-823和肝癌Hepg-2细胞增殖效应却相对较低(见图1)。从不同品种月份采集的叶片提取出的类黄酮抑癌效应上看，‘布兰瑞克’8月份叶片对SGC-7901细胞抑制率最高，其他品种以及月份叶片类黄酮的抑制率均比较低(见表2)。似乎只有特定品种和特定月份的无花果叶片类黄酮对特定肿瘤细胞增殖才有显著效应。有人提出，蝉花虫草醇提液对癌细胞增殖的抑制率也是SGC-7901最高。本试验结果与此相似。随着无花果叶片类黄酮浓度增加，胃癌SGC-7901细胞数目减少，变短皱缩，逐渐脱离细胞板，其抑制作用呈剂量效应(见图2)。这为无花果叶片的采收时机确定及类黄酮抑癌功效开发提供了理论依据。

我们首次利用流式细胞仪观察无花果叶片类黄酮诱导细胞凋亡(见图3)。在类黄酮浓度为200μg/mL时，细胞总凋亡率为39.08%；当浓度达1600μg/mL时，总凋亡率达83.60%。据此计算出无花果类黄酮对SGC-7901细胞半致死浓度为577. 25μg/mL。这与Purnamasari等提出的无花果甲醇提取液对肝癌细胞Huh7it半抑制浓度为653μg/mL相似。他们发现，无花果叶片甲醇提取液能抑制肝癌细胞增殖，促进凋亡，导致细胞坏死。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达和调控，主要包括内源性线粒体途径和外源性死亡受体调节途径。细胞线粒体膜电位下降是线粒体依赖性凋亡早期的一个标志性事件。García-Zepeda等证明，白藜芦醇诱导宫颈癌细胞系的线粒体膜电位降低，促进癌细胞凋亡。本试验观察到，无花果类黄酮降低人体胃癌SGC-7901细胞线粒体膜电位水平(见图4)。这表明无花果叶片类黄酮通过诱导SGC-7901细胞线粒体膜电位水平降低，促进细胞凋亡。

我们还观察了无花果叶片类黄酮对癌细胞周期的抑制效应，发现它将SGC-7901细胞有丝分裂主要阻滞在S期，也有部分在G2期(见图5)。曾报道，辣椒素能将子宫内膜癌细胞阻滞于S期，并引起凋亡率升高。据研究，辣椒素抑癌机理在于抑制细胞周期依赖性蛋白激酶CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达。人工合成的黄酮类氨基酸衍生物也能使MGC-803胃癌细胞周期受阻于G2/M期，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax表达，从而引发细胞凋亡。本试验在mRNA水平上分析无花果类黄酮抑制SGC-7901细胞凋亡机理。我们发现，经无花果叶类黄酮处理的SGC-7901细胞CDK1、CDK2、CDK6和CyclinD1基因表达显著下降，E2F1表达升高(见图6B)。在多种肿瘤组织中，CDKs都处于异常活化状态，抑制CDKs表达便能抑制肿瘤无序增殖。此外，无花果叶类黄酮处理还影响到抑癌基因P53和Bax以及促癌基因Bcl-2的表达(见图6A)。这三个基因中，Bax与Bcl-2属于同一基因家族，其中，Bcl-2促进细胞周期，而Bax与Bcl-2形成蛋白二聚体，拮抗后者活性，抑制细胞周期，引起细胞凋亡。据报道，天山雪莲类黄酮可导致人食管癌细胞CaEs-17Bax表达量上调，Bcl-2表达量下调，从而诱导细胞凋亡。我们观察到的无花果叶类黄酮促进抑癌基因P53和Bax表达，抑制促癌基因Bcl-2表达。这说明，无花果叶类黄酮对胃癌细胞SGC-7901的凋亡诱导作用可能是通过调节凋亡相关基因Bax、P53和Bcl-2的表达来实现的。

为挖掘无花果叶类黄酮抑制胃癌SGC-7901 细胞增殖效应的具体活性成分，根据不同品种不同月份无花果叶片类黄酮对人体胃癌SGC-7901细胞增殖抑制效率不同，我们选取三个( ‘布兰瑞克’8 月、‘玛斯义陶芬’9 月、‘波姬红’9 月)样品进行LCMS/MS定性定量分析。经筛选，获得12种与抑癌率高度相关的差异代谢物(见表3)。其中，水仙苷与无花果类黄酮抑癌率呈极显著正相关。曾报道，水仙苷具有抗病毒活性，还对阿尔茨海默症、Ⅱ型糖尿病、帕金森症等蛋白构象病的防治具有重要意义。最近有人提出，水仙苷可以用于防治新冠病毒。但是，它是否具有抑癌效应还有待研究。表3结果还表明，异荭草苷与无花果类黄酮抑癌率呈显著相关关系。有人报道，异荭草苷能够显著抑制胶质瘤组织miR-23a表达，从而抑制癌细胞增殖。因而，无花果叶片异荭草苷与抗肿瘤的关系值得深入研究。第三，桑色素能够抑制肿瘤细胞生长，且发生在细胞周期的S期。但也有人认为，阻滞发生在 G2 /M 期。本研究也检测出桑色素的存在，而且其含量与抗癌率的相关系数r=0. 9923，P=0. 08。虽然未达到0.05水平，但非常接近。而且，我们观察到无花果叶片类黄酮抑制SGC-7901细胞周期效应在S期。这与前人结果类似。由于无花果属于桑科榕属，这种黄酮物质是否与无花果抗癌活性有关，值得深入研究。此外，我们还观察到2. 6-二羟基苯甲酸、香草乙酮、氯化矢车菊素-3-O-芸香糖苷、烟花苷、表儿茶素、芥子酸等含量与无花果类黄酮抑癌率呈显著相关关系(见表3)。曾报道，儿茶素对人体肝癌有抑制效应。但是，本试验中，我们观察到无花果叶片类黄酮对肝癌HepG-2的抑制效应比较低(见图1)，因而推测，它对SGC-7901的抑制效应可能与表儿茶素无关。其他几种代谢物与抑癌效应的关系目前很少见报道。

综上所述，本文首先分析了‘布兰瑞克’、‘玛斯义陶芬’和‘波姬红’等3个品种叶片在7月到11月份间的类黄酮对不同癌细胞株增殖的抑制效率，发现‘布兰瑞克’无花果品种8月份叶片类黄酮对SGC-7901胃癌的抑制率最高。随着类黄酮浓度上升，癌细胞密度和粘附性下降，活细胞减少，死亡细胞和凋亡晚期细胞比例上升。抑癌机理研究表明，无花果叶类黄酮将细胞周期阻滞在S期以及少量的G2期，细胞线粒体膜电位明显下降，促细胞凋亡基因Bax和p53、细胞周期调控基因E1F2表达量显著上升，抗凋亡基因Bcl-2以及细胞周期相关基因Cy-clinD1和CDKs表达量显著下降。这些都是无花果叶类黄酮促进癌细胞凋亡的重要机制。此外，借助于LC-MS/MS技术和相关分析，我们筛选得到水仙苷、异荭草苷、桑色素等几种与抑癌率高度相关的差异代谢物。这为后续无花果叶片抗癌药物开发开辟了新视野。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2021年第9期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。

引用格式：

李晓,邓佳丽,安玉艳,等.基于类黄酮成分的不同品种无花果采收时机及抑癌活性研究[J].天然产物研究与开发,2021,33:1527-1538.

Li X,Den JL,An YY,et al.Study on harvesting timing and anti-cancer activity of leaves of different cultivars of fig based on flavonoids[J].Nat Prod Res Dev,2021,33:1527-1538.