箭叶淫羊藿中具有HDAC抑制活性的化学成分研究- 大数跨境

天然产物研究与开发

2021-11-11

导读：本文研究了在活性示踪指导下对箭叶淫羊藿HDAC抑制活性成分筛选和鉴定，首次从箭叶淫羊藿鉴定了具有HDAC抑制作用的活性成分：无异戊烯取代的黄酮苷化。

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在真核细胞内，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过移除核心组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基使组蛋白恢复正电性，从而与带负电荷的DNA紧密结合形成结构致密的染色质，抑制特定基因的转录。HDACs异常活化和肿瘤发生、组织发育异常等疾病密切相关。已有开发的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)应用于临床。例如，伏立诺他(SAHA)和Romidpesion已成为皮肤和外周淋巴细胞瘤治疗药物。HDAC抑制剂结构各异，既有短链脂肪酸类的丁酸、曲古菌素A(trichostain A)，环肽类的，也包括黄酮类的染料木素、山奈酚，是新药发现的一个热点。淫羊藿是一种补肾健骨中药，有强肌健骨、抗风湿、增进肝肾等功效；药理研究揭示了淫羊藿药材在增强性功能、调节激素、调节免疫、防治骨质疏松症等方面的作用。淫羊藿药材含有140余种不同类型的黄酮类成分，但罕有基于HDAC抑制机制研究淫羊藿抗骨质疏松活性成分的研究报道。本文报道我们在活性示踪指导下对箭叶淫羊藿HDAC抑制活性成分筛选和鉴定的结果。

本实验确定了箭叶淫羊藿70％乙醇提取物抑制HDAC活性较强的溶剂部位是乙酸乙酯部位，该部位用D101大孔吸附树脂处理，40％和60％乙醇洗脱物为HDAC抑制活性部位(见图1)；通过活性指导下的柱层析分离和波谱分析，从中鉴定了11个化合物。其中，非异戊烯取代的黄酮苷元(化合物1)和黄酮苷(化合物2~10)类成分全部显示了比淫羊藿苷更强的HDAC抑制活性，说明这一类成分是该植物抑制HDAC活性的主要活性成分。分离到的9种黄酮苷中有6种是山奈酚⁃3⁃O⁃单糖苷，包括得率较高的化合物5(山奈酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄吡喃糖苷)，说明山奈酚⁃3⁃O⁃单糖苷拥有相对较强的HDAC抑制活性。活性较低的化合物有7和８，由于糖基上一或两个羟基被对-香豆酸酯化，7和8的HDAC抑制活性低于异鼠李素⁃3⁃O⁃单糖苷(9和10)，说明山奈酚⁃３⁃Ｏ⁃单糖苷糖基被对⁃香豆酸酯化可减弱HDAC抑制活性(见表3)。但由于HDAC抑制剂筛选试剂盒提供的HDAC提取自HeLa的细胞核，是包含不同亚型HDAC的混合物，箭叶淫羊藿中分到的这些黄酮成分究竟抑制的是哪一种或哪几种HDAC的活性(功能)还需进一步研究方能得知。

如前所述，HDAC的抑制还可通过调节其在细胞内的表达达成。我们采用HeLa细胞进行的研究显示(见图2)，山奈酚⁃3⁃O⁃α⁃L⁃阿拉伯吡喃糖苷 (3)、山奈酚⁃3⁃O⁃β⁃D-木吡喃糖苷(4)和山奈酚⁃3⁃O⁃β⁃D-葡萄吡喃糖(5)对I类HDAC表达无明显影响，但能明显抑制Ⅱ型HDAC中的HDAC6(化合物3、4和5)和HDAC10(化合物4和5)的蛋白表达，是新发现的黄酮类HDAC蛋白表达抑制剂；其中4同时抑制其他Ⅱ类(HDAC4~7)和Ⅳ类(HDAC9~11)HDAC的蛋白表达，其作用值得深入研究。

HDAC通过对核心组蛋白的去乙酰化从而压制特定基因的转录，在细胞转录调控、细胞周期进程和生长发育活动等不同阶段中发挥重要作用。选择性HDACi可作用于过度表达的HDAC，使被其压制的基因得以正常表达，从而在治疗肿瘤、关节炎、组织发育不良等疾病方面发挥作用。例如，HDAC1\2(Ⅰ型)介导DNA损伤修复，在肺癌、胃癌等多种癌组织高表达。在对肿瘤进行放射性治疗时，同时使用HDAC1\2的抑制剂可阻止肿瘤细胞进行DNA修复从而促使癌细胞发生凋亡。HDAC8(I型)和HDAC10(Ⅱ型)的异常表达是神经母细胞瘤的进展和恶变的标志，HDAC6\8\10抑制剂TH34可诱导肿瘤细胞凋亡、有丝分裂中断和细胞周期阻滞，以此引起肿瘤细胞死亡；TH34与维甲酸联用可产生协同效果。HDAC4\6\7(Ⅱ型)的表达上调会造成成骨细胞分化过程中关键转录因子Runx2和Qsterix表达下调，从而不利于成骨细胞的形成；HDAC6基因和蛋白表达的上调也会诱导成骨细胞原纤毛变形和缩短，纤毛细胞数量减少，从而抑制成骨细胞的ALP功能，有效阻止骨形态发生蛋白(BMP)诱导的成骨细胞成熟。抑制HDAC6和HDAC4的表达或功能，将有利于成骨细胞分化和骨形成，保护骨密度。

本研究数据首次揭示，箭叶淫羊藿中的山奈酚⁃3⁃O⁃单糖苷(化合物3、4和5)具有明确的HDAC抑制剂样作用，三者对HDAC6蛋白表达的抑制作用，为将其识别为淫羊藿药材中潜在的具有山奈酚⁃3⁃O⁃单糖苷结构特征的抗骨质疏松症抗肿瘤有效成分，提供了实验依据。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2021年第10期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。