龙思丹1.2 季双双2 陈美池1.2 贠张君2 马银杰1 薛 鹏1 朱世杰1*
前言
胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的全球负担在过去25年中增加了一倍以上，预计2030年，PDAC将成为癌症相关死亡的第2大原因。PDAC患者五年的平均生存率仅8%，并且高达71%患者即使手术完全切除后也面临复发的风险。这种高致死率和高复发率的肿瘤特性是由PDAC 紧密的基质成分(物理屏障)决定的，其防止免疫效应细胞浸润到肿瘤中，使胰腺癌细胞能够逃避免疫监视。目前，许多临床试验尝试通过免疫治疗改善PDAC患者的整体疗效，包括免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、过继细胞转移等，单抗治疗的临床效果不佳，仍未取得突破性进展。
随着高通量遗传分析的出现，基因表达谱分析成为了鉴定各种疾病差异表达基因的有效方法。CIBERSORT是一种分析工具，它使用微阵列数据或RNA测序数据来评估样本中免疫细胞的表达，并获得各种免疫细胞比率。虽然目前已有多篇生物信息学针对PDAC差异基因进行了分析，但缺乏进一步对于免疫机制和治疗靶向预测的深入研究，尤其是在植物药的治疗潜力方面，中医已对于PDAC常伴见的黄疸、腹水等病症已形成系统认识，同时中药以多靶点的天然优势能有效干预复杂的免疫微环境，值得深入挖掘。因此，本研究利用基因芯片数据库(gene expression omnibus,GEO)，选择PDAC患者配对组织样本进行相关分析，从基因水平挖掘疾病机制，进行生存差异和免疫相关分析，通过CIBERSORT反卷积算法描绘PDAC组织中的免疫细胞浸润模式，最后综合预测和筛选潜在的有效中药，为临床药物的选择、研发提供依据。
代表性结果
目前，胰腺癌的免疫治疗取得了一定进展，给临床治疗胰腺癌带来了希望，然而，由于胰腺癌的微环境通常包括免疫抑制细胞增多、免疫细胞失活和肿瘤突变负荷低等状态，多数免疫治疗结果并不令人满意。随着高通量技术的发展，Lv等人通过多个数据集来挖掘胰腺癌的差异核心基因、Xiao等人通过“炎-癌”差异基因挖掘中药等等，都加深了对胰腺癌发病分子机制的理解，但是对于该病免疫相关机制的工作开展不足，不利于改善患者的长期生存预后。因此，本研究首次在差异基因的基础上，进一步挖掘相关免疫浸润机制和潜在有效中药，旨在完善机制和促进药物开发。首先，本研究通过GEO数据库筛选合适的基因芯片，比较同一个体患者的胰腺肿瘤与正常组织样本的基因表达谱，得到2653个差异基因，并通过PPI得到核心差异基因，分别是细胞外基质组织和胶原纤维组织相关基因(COL1A2、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2)、ADAM金属肽酶(ADAMTS2)、基膜聚糖(LUM)、整合素亚基α2(ITGA2)、纤维连接蛋白(FN1)、基质金属蛋白酶(MMP2)。以上差异基因经证明在肿瘤组织中均表达上调，与胶原蛋白代谢相关，多属于COL1、COL3和COL5家族，其中COL1A2的表达通过qRT-PCR测定验证在组织中表达最高，反应此次结果可信度高。与其他实体瘤不同，PDAC肿瘤微环境是一个包含胰腺星状细胞、癌相关成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质过度纤维化的致密基质环境，基质中密集纤维化反应和肿瘤在免疫环境中的改变被认为是目前PDAC治疗失败的主要原因。进一步通过生存分析研究揭示该类核心差异基因与PDAC患者RFS显著相关，并且与多种肿瘤细胞浸润程度呈正相关，提示该类基因可能通过改变肿瘤免疫微环境介导PDAC患者的临床预后，如何借助该点改变临床结局成为可能的突破口之一。
进一步对差异基因进行GO及KEGG富集分析，提示差异基因的生物学过程涉及中性粒细胞脱颗粒、迁移、趋化因子、T辅助细胞分化、体液免疫反应等过程。PDAC微环境本质上是炎症的，趋化因子等促进肿瘤炎性微环境的事实也已经被证明，除细胞因子和趋化因子外，中性粒细胞的激活往往是第一个分子事件，随后发生迁移向肿瘤组织趋化。已经明确的是PDAC癌细胞可以将多形核中性粒细胞募集到肿瘤附近，但大多无法产生抗肿瘤反应，通常高丰度的中性粒细胞数量会促进PDAC的进展，与预后不良有关；最近体外实验表明，胰腺癌细胞诱导中性粒细胞胞外陷阱形成，从而促进PDAC肝脏微转移的发生；同时高度纤维化导致的局部缺氧变化决定了免疫环境，活性氧的持续释放导致局部缺氧，从而增强中性粒细胞浸润，因此，中性粒细胞在胰腺癌微环境中至关重要。并且，本次研究结果提示差异基因直接参与了T细胞的分化和体液免疫的调节。
为深入探索免疫浸润在PDAC发病中的作用，本研究利用CIBERSORT反卷积法对总体肿瘤样本进行分析，与正常胰腺组织相比，肿瘤组织中M2巨噬细胞、静息记忆CD4+T细胞显著增高，而CD8+T细胞显著下降，在配对样本中观察到了同样趋势。M2巨噬细胞产生促进肿瘤进展的抗炎信号，经确认是胰腺癌预后不良的标志之一。2013年，一项通过IHC观察PDAC患者免疫细胞浸润程度的研究表明，较高水平的肿瘤浸润性泛巨噬细胞M2、Tregs与CD4+T与较短的生存期显著相关。在PDAC小鼠模型中已经证明肿瘤相关巨噬细胞通过释放细胞因子、蛋白酶和生长因子介导免疫抑制和血管生成并促进肿瘤进展，并且，抑制CCR2已被证明可通过阻断单核细胞募集到肿瘤微环境中来提高化疗效果、抑制转移、增强放疗效果并增加T细胞免疫浸润。因此，巨噬细胞极可能成为人类PDAC新治疗策略的潜在目标。既往认为由成纤维细胞和促纤维母细胞组成的PDAC免疫抑制微环境会限制T细胞浸润，但最近的研究揭示了T细胞的特定空间分布，正如相关性热图显示胰腺癌组织中静息的记忆CD4+T细胞与CD8+T细胞之间存在显著负相关(r=-0.64)，这已被证明是预后不佳的标志之一，尤其是PDAC，CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润与肿瘤细胞紧密接近和患者存活率紧密相关。最近有学者强调在长期幸存者中建立成功的免疫更需要高丰度的肿瘤内CD8+T细胞，了解CD8+T细胞的驱动因素以及CD8+T细胞的浸润机制，对于进一步开发PDAC治疗方案至关重要。目前，PDAC免疫浸润细胞之间的关联尚缺乏大规模的验证，本预测具有一定参考意义。
PDAC在中医属于“脾积”“癥瘕”“积聚”“痞气”“伏梁”等范畴。病例系列文献研究和Meta分析结果提示联合中医药治疗PDAC能够有效降低患者死亡率，改善远期预后。最近基础研究揭示中草药治疗PDAC的机制多通过改善肿瘤微环境而间接改善医疗结局，故探索肿瘤免疫微环境对寻找有效中药十分重要。目前，PDAC中医病机多认为是“本虚标实”，以湿热蕴毒为著，而本研究预测中药的功效多属于清热类(黄芩、山慈姑、牡丹皮、紫草等)，其次为补益药(人参、杜仲、仙茅、龟甲、阿胶等)，符合中医病机。从病位而言，对比中医古籍中关于解剖位置和生理功能的描述，多数学者支持将胰归属于五脏中的脾，但本次研究显示绝大多数有效预测中药归属肝经，其次是肺、肾经，提示我们或许从肝论治湿热，结合扶助脾虚能够进一步提高治疗有效率，经检索发现该理论已有散在经验和综述报道，值得深入探讨形成系统认识。此外，本研究利用反向预测的方法获得了数味中药，在关联度较高的中药队列中，研究发现人参皂苷能够通过下调MMP2等表达从而减少血管生成，降低肿瘤细胞营养供给；姜黄素通过Wnt/β-Catenin信号通路活性抑制PDAC干细胞的自我更新，并可改善PDAC皮下移植瘤模型组织的局部微循环, 增加肿瘤微环境中的供血供氧, 抑制肿瘤细胞和间质细胞的低氧应激反应；以上文献支持了本研究的部分预测结果，但有关中药治疗PDAC相关免疫机制的研究开展仍十分不足。
本研究在筛选基因芯片时考虑到免疫机制分析的个体差异，严谨筛选了采用配对样本分析的PDAC实验数据，同时考虑到本研究本质上是对既往单个GSE数据的二次挖掘，采用了不同水平来验证核心差异基因的表达，降低了风险。但是本研究仍存在以下不足：(1)由于样本量过少导致数据分析具有一定偏倚，后期纳入更多符合要求的数据集来进行分析；(2)CIBERSORT反卷积算法分析是基于有限的遗传数据，这些数据可能会偏离细胞异型相互作用、疾病的诱发因素以及疾病表型的可塑性，临床和基础试验可以更加全面、客观地反映个体免疫情况。总之，本研究首次利用生物信息学技术结合CIBERSORT反卷积算法探索了PDAC的免疫浸润机制，并预测潜在可能有效的中药，对未来该领域的研究具有一定价值。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2023年第2期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：龙思丹,季双双,陈美池,等.基于生物信息学筛选的胰腺癌差异基因及免疫浸润机制预测靶向中药[J].天然产物研究与开发,2023,35:319-331. Long SD,Ji SS,Chen MC,et al.Bioinformatics-based screening of pancreatic cancer differential genes and immune infiltration mechanisms to predict targeting of traditional Chinese medicine[J].Nat Prod Res Dev,2023,35:319-331.
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