基于斑马鱼模型和动态分子对接技术探讨西洋参抗缺氧作用及潜在靶点- 大数跨境

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基于斑马鱼模型和动态分子对接技术探讨西洋参抗缺氧作用及潜在靶点

天然产物研究与开发

2023-05-08

导读：本研究利用斑马鱼模型和动态分子对接技术研究西洋参抗缺氧作用及潜在靶点。

马智慧1,2 董榕2 赵焕新2 刘慧茹1,2 丛媛青2 韩欣颖2 李正国1,3* 韩利文2*

1 山东中医药大学药学院

2 山东第一医科大学( 山东省医学科学院) 药学与制药科学学院

3 山东省济宁市食品药品检验检测研究院

前言

缺氧(hypoxia)是一种由多种因素引起的复杂的病理过程，是指机体有不同程度的呼吸困难，通过呼吸道不能摄入过多足够的氧气，而导致机体发生病理变化，比如出现皮肤、手指、口唇等皮肤黏膜紫绀，甚至出现喘息、气促、胸闷等症状。缺氧可诱发心、脑、肺等多器官的不可逆损伤，进而可能发展为肺水肿或脑水肿等致命性疾病。传统中药在抗缺氧研究及临床应用具有明显的优势，如雪莲、手掌参等均已经证明具有较好的抗缺氧效果。深入挖掘祖国的特有药用植物资源，发现更多的高效低毒的药物，对于高原环境或病理引起的缺氧的防治仍具有重要意义。

目前用于抗缺氧疾病研究的模型主要为大鼠和小鼠模型，主要的方法有负重游泳实验、常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验和急性脑缺血性缺氧实验，在大规模药物筛选方面具有局限性且成本较高。研究发现，斑马鱼可以通过亚硫酸钠建立缺氧模型，而且斑马鱼产卵量高、实验周期短、成本低，可以实现高通量筛选。因此，我们采用模式动物斑马鱼探究西洋参的抗缺氧作用，并使用生物信息学的技术与方法，筛选和预测西洋参活性成分与潜在作用靶点，寻找西洋参抗缺氧作用的潜在靶点，为西洋参抗缺氧作用机制研究提供参考。

代表性结果

讨论与结论

本文构建了斑马鱼幼鱼抗缺氧新模型，为中药抗缺氧研究提供了新的方法。本实验以亚硫酸钠构建低氧环境，代替了常见的充氮气制造缺氧模型的方法，以更简单直接的操作来研究西洋参抗缺氧作用。选用斑马鱼为模型动物，既可以减少实验周期、实现高通量筛选又可以从整体来对缺氧进行表征。斑马鱼缺氧后，会出现浮头现象，而且会泳姿失衡，身体与水平不平行，无规律地向四周游动，在一定时间内游泳速度增加。本研究通过对各组斑马鱼在缺氧条件下的存活时间以及缺氧后的神经行为(浮头、游泳速度及距离)进行评价，发现西洋参提取物可以显著提升缺氧条件下斑马鱼的存活时间，随着给药浓度的提升，每组斑马鱼的浮头率也显著下降，缺氧后的运动距离和速度也较模型组有显著差异，其中高剂量给药组的神经行为接近空白常氧组，提示西洋参提取物有显著的抗缺氧作用，为下一步寻找抗缺氧潜在靶点奠定基础。

西洋参为五加科人参属植物，原产于加拿大，现我国吉林省、山东省已大量种植。早在中国清代儒医汪昂编著的《补图本草备药》中就有相关记载，西洋参性凉，味甘，微苦，具有补气养阴，清热生津等传统功效。现代药理学表明，西洋参具有多种药理活性，包括抗肿瘤、心血管保护、免疫调节，还具抗心肌缺血、抗心肌氧化等作用。但是到目前为止人们对西洋参抗缺氧的作用及具体物质成分靶点的了解还十分有限。已有研究显示人参皂苷Rg3在缺氧条件下可以抑制Eca-109和786-0细胞的增殖，并诱导血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达显著降低，同时可抑制低氧条件下缺氧诱导的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、环氧合酶-2(COX-2)和核因子κB( NF-κB)的表达; 人参皂苷Rb3可以稳定细胞膜，抑制NOS的表达和活性，对缺氧缺血性神经元损伤具有明显的保护作用。因此深入挖掘西洋参中的关键抗缺氧药效物质对于质量评价及新药研发具有重要意义。

PPI网络的拓扑分析结果提示AKT1、STAT3、HSP90AA1、JUN、TNF可能是西洋参抗缺氧的核心靶点基因。AKT1作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可由PI3K与生长因子结合后活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相关蛋白Bad、Caspase9、mTOR活性，从而参与调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等生物过程。研究发现，通过重组慢病毒介导Akt1基因转染可通过抑制凋亡显著提高大鼠BMSCs的缺氧耐受能力。STAT3是STAT家族成员，在调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程中起关键作用。在缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞中，STAT3发挥着重要作用，阻断STAT3信号通路可有效抑制血管平滑肌细胞的增殖。HSP90AA1是热休克蛋白家族的一员，作为非应激细胞中最丰富的细胞质蛋白之一，在维持细胞稳态过程中起关键性作用，可在缺氧应激的条件下，提高细胞对外界应激的抵抗力。JUN属于原癌基因家族，是MAPKs超家族成员之一，可参与细胞的增殖、炎症、迁移和侵袭等过程，缺氧条件下磷酸化c-jun氨基末端激酶的表达水平提高可以促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖。TNF是一种主要由单核细胞和巨噬细胞分泌的促炎细胞因子，它在广泛地调节炎症效应和宿主防御微生物病原体方面起着至关重要的作用，缺氧应激时，TNF通过NF-κB通路调节HIF-1α(缺氧诱导因子-1α)的转录水平。

本研究动态分子对接发现西洋参关键化合物(拟人参皂苷F11、罂粟碱、人参皂苷RO、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3)与缺氧核心靶点基因(AKT1、HSP90AA1、JUN、STAT3、TNF)可以很好结合。本分子对接研究确定晶体结构中原配体位置为活性对接口袋，保证了西洋参关键化合物与缺氧靶点蛋白结合位置为关键活性区域。结合能越低，配体与靶蛋白的结合能力越强，通过各化合物与靶点对接发现，促炎因子TNF与热休克蛋白HSP90AA1与关键活性成分结合能力较强，可能为西洋参抗缺氧潜在关键靶点。通过分子动力学对进一步验证，发现HSP90AA1和人参皂苷Rg1、TNF和人参皂苷Ro的动态模拟均能形成稳定构象，揭示和验证了该核心靶点和化合物复合物的结合紧密度与稳定性，为西洋参抗缺氧作用的潜在缺氧靶点研究提供可靠的理论依据。

综上，本研究通过斑马鱼模型评价西洋参抗缺氧作用，并利用网络药理学技术对参与抗缺氧的活性成分、核心靶点做了初步探索，借助分子对接技术和分子动力学对活性成分与核心靶点的结合进一步验证，揭示了西洋参抗缺氧可能潜在的靶点。由于中药成分的复杂性以及西洋参皂苷类成分分子结构等特点，以网络药理学为基础的初步探索仍显不足，针对预测结果中西洋参抗缺氧的作用靶点，后期将进一步给与实验验证，以期为西洋参抗缺氧的药效组分研究提供理论依据及参考，为后期相关机制研究提供依据。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2023年第4期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。

引用格式：马智慧,董榕,赵焕新,等.基于斑马鱼模型和动态分子对接技术探讨西洋参抗缺氧作用及潜在靶点[J].天然产物研究与开发,2023,35:592-601. Ma ZH,Dong R,Zhao HX,et al.Exploring the anti-hypoxic effects and potential targets of American ginseng based on zebrafish model and dynamic molecular docking techniques[J].Nat Prod Res Dev,2023,35:592-601.