基于网络药理学和分子对接探索荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的潜在机制

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       2019年12月，武汉爆发了由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎。患者以发热、乏力、干咳为主要表现，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血障碍等。截止2020年5月26日24时，我国已累计报告确诊病例82 993例，现有确诊病例79例（其中重症病例5例），累计治愈出院病例78 280例，累计死亡病例4 634例，同时海外感染发病持续上升，现累计确诊病例已超过550万例。这是21世纪短短20年间冠状病毒在2003年严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）、2015年中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）之后第三次大规模流行。冠状病毒每次大规模流行都严重威胁人类健康，给社会和经济的发展带来严峻挑战和沉重负担。然而，临床对治疗冠状病毒引起的肺炎尚无特效药，多采用支持治疗为主，因此相关药物研究迫在眉睫。

       自新型冠状病毒疫情发生以来，根据各省市自治区相关诊疗方案和建议，中医药已经广泛应用于新型冠状病毒的治疗，其中多省市推荐中药中用到了荆芥、防风。荆芥（Schizonepetae Herba，SH）为唇形科植物荆芥（Nepeta cataria L.）的干燥地上部分。其味辛，性微温，具有解表散风，透疹，消疮之功效。防风（Saposhnikoviae Radix，SR）为伞形科植物防风（Saposhnikovia divaricata (Trucz.) Schischk.）的干燥根，味辛、甘，性微温。具有祛风解表，胜湿止痛，止痉之功效。荆芥和防风是《宣明论方》所记载的防风通圣丸的君药，二者作为散风寒、祛风胜湿的药对收载于《施今墨药对》。荆芥和防风均具有解热、镇痛、镇静、抗菌、抗炎、止血等作用。

       自2008年提出以来，网络药理学作为一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科，由于其整体性、系统性的研究方法和注重药物间相互作用的特点与中医药学多靶点、多通路的作用特点相吻合，已经成为系统性分析中药复方多靶点，多通路作用机制的有效工具。多项研究利用网络药理学探索中药作用机制已经取得成功。综上，本文拟通过网络药理学和分子对接方法探究荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的潜在机制，为荆芥-防风的临床应用提供参考。首先，通过检索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库收集荆芥-防风中活性成分及其作用靶点，并在GeneCards、OMIM、NCBI Gene数据库收集冠状病毒肺炎相关靶点。然后，两者取交集运用STRING数据库分析关键靶点间蛋白相互作用，并利用DAVID数据库进行生物功能和通路分析。最后，利用Autodock软件对潜在药效物质和关键靶点进行分子对接。

图1 荆芥-防风药对成分-靶标网络图

图3 56个关键靶点PPI网络图

 Fig. 3 PPI network of 56 key targets 

图5 成分-靶标-通路网路图

图6 活性成分与ACE2、COVID-19 main protease的分子对接模式

       荆芥和防风为常见疏风解表、清热退热类中药，具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热等药理作用。自新型冠状病毒疫情发生以来，荆芥和防风被广泛的应用于冠状病毒肺炎的治疗，有较为满意的临床疗效，提高了临床治愈率，然而其作用机制并不明确，同时缺乏分子水平实验研究。因此，深入研究分析荆芥-防风治疗冠状病毒肺炎作用机制，探索其潜在作用靶点，为荆芥-防风后续分子机制研究提供了方向，同时对临床应用具有重要意义。本文基于网络药理学和分子对接技术研究了荆芥-防风治疗冠状病毒肺炎的活性成分、潜在作用靶点和作用通路。发现荆芥-防风药对可能通过luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol等活性产物，作用于IL6、TNF、MAPK1、IL1β、TP53等靶点，调节炎症反应、正调控RNA聚合酶II启动子转录、免疫应答、负调控凋亡过程等生物过程，通过TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等发挥多成分、多靶点、多通路抗冠状病毒肺炎的药理作用。

       PPI网络图参数显示，IL6、TNF、MAPK1、TP53、IL1β、RELA、IL10等23种蛋白度值高于平均值，说明其在PPI网络中与其他蛋白联系紧密、相互作用较强。其中，IL6、IL1β、TNF、IL10等炎性因子相关蛋白均具有较高的度值，处于网络的中心位置，这些靶点蛋白均参与呼吸道疾病的免疫应答和炎症过程，与炎症反应对呼吸道的刺激密切相关。一项最新的关于冠状病毒肺炎患者遗体解剖研究显示，死者肺部损伤明显，炎性病变清晰，说明炎症反应在冠状病毒肺炎的病情发展中发挥了重要作用，荆芥-防风可能通过这些靶点发挥抗炎作用。Kindrachuk等研究表明，靶向MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路的抑制剂无论是在病毒感染之前还是之后，都抑制冠状病毒的复制，KEGG富集结果同样显示，MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路富集结果具有统计学差异。HIF-1信号通路同样在维持肺泡上皮细胞稳态和疾病发病机制中发挥了重要作用，与KEGG通路富集结果一致。说明荆芥-防风药对中活性物质可能通过MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和HIF-1信号通路发挥抗冠状病毒肺炎药理作用。

       通过网络药理学筛选，我们发现luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol化合物在“成分-靶点-通路”网络中度值高于平均值。因此，我们将这四种成分与PPI网络中度值前五的分子进行对接，结果显示这四种成分与IL6、TNF、MAPK1、IL1β对接能量均小于-5 kcal/mol，beta-sitosterol与TP53对接结果小于-0.5 kcal/mol。说明荆芥-防风的活性化学成分可以和IL6、 IL1β、TNF和TP53蛋白较稳定的结合。同时，已研究表明，luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol均表现出较好的抗炎活性，表明这些成分在荆芥-防风药对抗炎作用中扮演了重要角色。由于冠状病毒肺炎为新发疾病，疾病靶点收录并不完整，我们将度值大于平均值的化学成分与SARS病毒ACE2和COVID-19 main protease进行了对接验证，发现四种化学与ACE2、COVID-19 main protease均取得较好对接结果。说明荆芥-防风活性物质可能与这两种蛋白结合发挥抗冠状病毒肺炎的作用。

       综上所述，本研究通过网络药理学的分析方法对荆芥-防风药对治疗冠状病毒肺炎的药效物质和作用靶点进行研究，并通过分子对接技术对筛选出的靶点进行验证，同时对接了活性物质与SARS病毒受体ACE2和COVID-19 main protease，发现了荆芥-防风潜在的抗冠状病毒可能性，为荆芥-防风临床应用与开发提供了支撑，也为课题组后续荆芥-防风活性物质筛选及作用靶点研究打下了基础。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2020年第7期，欢迎引用（点击左下方“阅读原文”可查看全文）。

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