马瑞丽1,2 胥生荣1,2* 张金晶1
2 青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室
羌活(Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang)为伞形科羌活属植物，以其干燥的根茎入药 ，是传统中藏药常用药材，俗称黑药，市场需求较大。目前羌活主要来源于野生资源，其主要分布于四川、甘肃、青海等地海拔3000~4500m的灌丛草甸区。近年来由于过度采挖，对生态环境造成了极大的破坏，并且野生羌活资源趋近于枯竭，因此人工驯化栽培迫在眉睫。
羌活种子成熟落地时，胚发育不完全，常出现无胚或原形胚现象，具有形态和生理双重休眠特性，属于深度休眠种子，自然环境下羌活种子发芽率 极低(0.52%)。目前解除羌活种子休眠的有效方法是GA+变温沙藏法，首先用暖温沙藏法解除其形态休眠后，须再经过低温沙藏处理解除其生理休眠后才种子才具备发芽能力，种子处理时间长达8个月以上，采用此方法处理羌活种子，最高发芽率为21.2%。加之羌活药材生长周期在4年以上，因投资周期长、见效慢，导致人工种植发展十分缓慢，目前只有零星种植，不能满足羌活市场的可持续发展需求。人工解除羌活种子休眠技术十余年来 未得到突破性进展，这是制约羌活大规模栽培的主要问题之一。
植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，与宿主植物在长期共处中形成了一种 复杂、特殊的互利共生关系，通过提高植物体内生长素和分裂素等代谢，发挥其促进植物的细胞分裂、根系发育、幼苗生长的功能。种子的休眠受 控于赤霉素类生长促进物和脱落酸类生长抑制物质间的平衡。研究发现内生菌能够通过调节或诱导合成植物内源激素调控种子的休眠，这为研究种子中具促生功能内生菌资源挖掘提供了理论依据。普风雅等研究发现薏苡内生菌能提高薏苡、水稻、小麦种子的发芽率，并通过诱导根系生长促进幼苗生长。雷瑞峰发现银砂槐种子内生菌通过调控种子代谢，促进其种子萌发进程。向益青等研究发现黄连种子内生菌可显著提高黄连种子的发芽率。川椒(Capsicum annuum)、水稻(Oryza sativa L.)、铁皮石斛(Dendrobium catenatum)的内生菌均通过分泌auxin、abscisic acid、cytokinin、gibberellic acid等植物内源激素类物质直接促进宿主植物的生长发育。分离自醉马草(Achnatherum inebrians)、金钗石斛(Dendrobium nobile)、黑麦草(Lolium rigidum)种子的内生菌和分离自多花黄精(Polygonatum multiflorum L.)根部的内生菌均以分泌cytokinin等植物内源激素的方式调控种子的休眠，显著提高其种子的发芽率和存活率。然而，羌活种子内生菌是否能够通过促进其种胚的生长而发挥促休眠解除的作用？基于此，本实验以羌活种子为研究对象，利用Illumina MiSeq免培养高通量测序技术研究羌活种子不同休眠状态内生菌群落结构组成和差异性，为进一步研究利用微生物解除羌活种子休眠提供理论基础，也为种子具有相似休眠特性植物的栽培提供重要理论参考。
种子作为植物重要的繁殖器官，能够作为微生物从母本植物到下一代植物的传播介质，通过垂直传播的方式将有益微生物代代相传，进而发挥促种 子萌发和幼苗生长的作用。水稻和玉米等禾本科植物种子内生菌对其种子萌发、幼苗生长发育及宿主植物的生长具有重要作用。金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)种子存在后熟现象，且缺乏胚乳组织，需与微生物共生才能萌发，其优势内生细菌主要为变形菌门和蓝细菌门。本研究发现，羌活种子在三个不同休眠状态，内生菌群落种类在门水平上类似，其中内生细菌主要由变形菌门、放线菌门、厚壁菌门组成，这与其他植物种子的优势内生细菌门一致，而与金钗石斛种子相比，其优势内生细菌门具有差异性。植物分泌物类型以及微生物在植物组织中定殖、存活并传播给种子的能力不同，不同植物种子内生菌存在差异。因为种子内生菌来自不同植物器官或分生组织，通过微管连接或配子，转移、定殖于种子胚和胚乳，并垂直传播。药用植物羌活和金钗石斛种子均因具有休眠特性而发芽困难，但研究发现两者优势内生细菌门具有差异性，这可能是由于其内生菌来源不同所致，因为羌活种子是因为胚未发育完全而导致的休眠，其内生菌主 要来源于胚乳，而金钗石斛种子是因为无胚乳而导致的休眠，其内生菌主要来源于胚，因此两者的内生菌种类在门水平存在差异，推测羌活种子也需与微生物共生才能萌发。羌活种子在GSC状态出现了少量的内生细菌门类杆菌门(2.01%)，在GSB、GSC状态分别出现了内生真菌门的未知菌24.33%、7.74%，这些内生菌对促进种子胚生长而发挥解除种子休眠的作用可能具有重要贡献，是今后研究的重点。内生真菌在许多植物的种子中都有较高的丰度和多样性。羌活种子内生真菌主要由子囊菌门和担子菌门组成，这与菜豆(Phaseolus vulgaris L.)种子、金钗石斛种子中优势内生真菌保持一致。
在属水平上，从GSA到GSB状态，内生菌群落组成发生变化，从GSB到GSC，内生菌群落种类相似。通过Alpha多样性分析发现，GSA内生细菌多样性显著低于GSB和GSC，而GSB于GSC内生细菌多样性差异不显著，主要原因可能是由于在GSA状态，变形菌门占绝对优势，比例达97.08%，从而抑制其他细菌生长，而GSB和GSC状态种子长期处于相对缺氧环境，进而导致微生物竞争相对较小，微生物之间不存在明显的抑制作用，进而多样性指数高于GSA状态。内生真菌群落多样性在种子整个休眠解除过程中无显著性差异。通过Beta多样性PCoA分析发现，内生细菌群落结构从GSA到 GSB再到GSC状态发生了显著性变化，而内生真菌群落结构从GSA到GSB发生显著变化后直到种子生理休眠解除，群落结构变化不大。羌活种子成熟落地，经过长时间的暖温层积和低温层积处理后才具备发芽能力，期间其种子内生菌群落结构发生改变，说明这是羌活种子具备发芽能力的主要影响因素之一，其作用机制有待进一步研究。
植物种子内生菌的作用尚未阐明，但已有大量研究表明种子内生菌对宿主植物及种子具有调控作用。黑麦草内生菌可产生细胞分裂素，并与植物产生的植物激素相互作用，从而调控种子的休眠。种子内生菌还能通过产生植物激素或促进植物营养吸收，特别是氮、磷等的获得而促进植物生长。本研究进一步分析了GSA、GSB、GSC在属水平的特征微生物，内生细菌共15种，内生真菌无特征微生物，这些微生物在各自的休眠阶段相对于其他休眠阶段，丰度是较高的微生物，可能对羌活种子形态休眠的解除和生理休眠的解除具有重要作用，是今后研究的重点微生物群体。其中GSA状态优势菌属为欧文氏菌属、假单胞菌属，假单胞菌属参与许多果蔬的腐败过程，约有50%～90%的腐败菌为假单胞菌属细菌，欧文氏菌属分泌的果胶酸裂解酶和果胶甲基半乳糖醛酸酶在协同作用下具有软化植物组织的作用，可降解植物细胞壁上的果胶，从而发生软化腐败，本研究结果说明新鲜收货的羌活种子必须要及时进行沙藏处理以防发生腐败现象而影响种子发芽。黄志远等研究发现，石竹(Phyllostachys nuda)笋在贮存过程中，欧文氏菌属相对丰度随贮存温度升高而降低，本研究发现新鲜收货的羌活种子经过暖温处理(15℃) 后其丰度显著降低，这与前人研究结果一致，可能与种子经过暖温沙藏处理，胚乳被出现的优势菌属大量分解后产生能量供种胚发育从而间接地抑制了其生长有关。羌活种子成熟落地时种胚未发育，需经过长达8个月的暖温沙藏而解除其形态休眠，这与胚乳中存在难以生物降解的发芽抑制物有关。红游动菌属具有脱氮作用，是具有降解有机物及一些难以生物降解的含氮化合物的功能菌。本研究发现在GSB状态，优势内生细菌为红游动菌属和Catellatospora属，其可能发挥对发芽抑制物的降解作用而促进种胚生长有关，是今后研究的重点菌群。GSC状态优势菌属为德沃斯菌属、Steroidobacter属、慢生根瘤菌属、粘球菌属、分枝杆菌属、水栖菌属、小单孢菌属、支动菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属和Mycetocola属。研究发现德沃斯菌属为固氮菌; 慢生根瘤菌属有溶无机磷酸盐的能力，可提高植物光合作用色素含量; Mycetocola属菌株最初发现地为米堆冰川，为耐寒微生物。羌活种子经过暖温沙藏解除形态休眠后不具备发芽能力，必须经过低温沙藏处理后才具备发芽能力，推测其形态休眠解除后，胚乳消耗殆尽无法满足胚芽和胚根的进一步生长所需的能量，形态休眠解除阶段积累的红游动菌属微生物降解含氮发芽抑制物的氮素产物无法被种胚直接吸收，必须通过固氮微生物转换为植物可吸收的氮素后才能促进胚芽生长和胚根突破种皮，推测固氮微生物需与Mycetocola属微生物协同才能正常生长，而Mycetocola属微生物只能在低温环境下正常生长，因此羌活种子形态休眠解除后必须经过一段时间的低温处理后胚根才能突破种皮，种子具备发芽能力。推测GSC状态种胚中的特征微生物慢生根瘤菌属细菌能够增加胚芽中的光合色素含量，为胚芽的光合作用作准备。
由于羌活种子成熟落地时为原型胚或无胚，人工栽培中育苗时种胚生长十分缓慢，导致羌活种子萌发时间长，萌发过程困难，自然状态下长达11个月才能萌发，亟需从微生物的角度出发寻找到促进其种胚生长以解除其形态生理休眠的微生物，为羌活的人工栽培发展提供有力保障。本实验通过免培养高通量测序方法，对羌活种子不同休眠状态内生细菌和内生真菌的群落结构组成和差异性进行了深入研究，分析出了各休眠状态的特征微生物，本论文为利用微生物方法解除羌活种子休眠提供了新思路，填补了微生物促种子休眠解除研究领域的空白，为进一步利用这些潜在具有促休眠解除作用的内生菌资源提高羌活种子萌发率，促进其人工栽培规范化发展奠定了基础，且有望为采用微生物方法如工程菌株或微生物制剂等快速解除种子休眠的技术提供理论指导。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2024年第5期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：马瑞丽,胥生荣,张金晶.羌活种子不同休眠状态内生菌群落结构组成和差异性分析[J].天然产物研究与开发,2023,36:805-814. Ma RL,Xu SR,Zhang JJ.Community composition and differential analysis of endophytic in different dormancy states of Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang seeds[J].Nat Prod Res Dev,2023,36:805-814.
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