杨 莉1,2 唐 其1,2 范明慧1,3 王 燕1,2 张睿胤1,2 周 铁3 陈 鹏3* 郑亚杰1,2*
3 湖南省农业科学院园艺研究所
枳壳为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中、行滞消胀等功效，富含黄酮、生物碱和挥发油等化合物，具有抗抑郁、抗炎、降血脂、调节胃肠功能、抗肿瘤等作用。在湖南、江西、四川等长江流域及以南地区广泛分布，湖南枳壳销往全国各地和大量出口，产量占全国总产量的40%~60%以上，习称湘枳壳(Hunan Aurantii Fructus,HAF)。湘枳壳不同产地、不同批次药材的化学成分含量存在差异，且目标成分的色谱峰强度变化与产地有关联，而指纹图谱技术或多指标定量分析多是从化学角度出发，所选枳壳药材的检测指标未能兼顾“谱-效”之间的关联性。
中药质量标志物(quality marker,Q-Marker)指与中草药安全性和有效性密切相关的化合物，可通过文献预测、成分特有性结合网络药理学、多组分多组学等进行梳理。网络药理学在生物信息学、系统生物学和药理学基础上兴起，具有系统性和整体性特点，通过构建药材化学成分与其潜在靶点的相互作用网络，系统地预测靶点的作用通路和作用机制，实现Q-Marker的理论筛选。枳壳种质资源样本未规模化种植，通常样品偏少无法利用动物试验开展“谱-效”关系研究。本研究通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和气相色谱法(gas chromatography,GC)多指标定量分析方法，结合网络药理学和分子对接技术从“谱-效”关系维度筛选出湘枳壳药材的候选Q-Marker，借助多变量统计分析挖掘可用于湘枳壳种质资源区分的关键Q-Marker，以期为湘枳壳品种选育及品质评价供技术手段。
枳壳等柑橘属植物挥发油多采用气相色谱-质谱联用技术定性分析，结合面积归一化法对D-柠檬烯等进行相对定量分析。本研究通过顶空固相微萃取-气相色谱法对湘枳壳种质资源样本挥发性成分进行定量测定，发现挥发性成分以D-柠檬烯和芳樟醇为主，柠檬烯平均含量占总值比例约90%；湘枳壳样本间挥发性成分的含量差异较大，在湘枳壳药材品种选育时应对挥发性成分予以高度重视。
作为传统大宗理气药材，枳壳所含的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、川陈皮素、橘皮素、柠檬苦素、橙皮油素、芦丁、圣草次苷、β-月桂烯、D-柠檬烯、β-蒎烯、α-石竹烯、ɑ-松油醇、香叶醇、4-萜品醇和芳樟醇等21个化合物，因具有潜在的理气功效可作为候选Q-Marker。结果表明，柚皮苷和新橙皮苷的含量符合《中国药典》2020年版规定，研究样本均可作药材入药；而多指标测定结果显示湘枳壳种质资源样本间存在较大差异，在湘枳壳种质资源的选育和品质评价中应慎重选择。
借助网络药理学和分子对接技术在理论层面上通过“谱-效”关系筛选湘枳壳药材的潜在Q-Marker。本研究从上述21个化合物中进一步筛选出橘皮素、柚皮素、柠檬苦素、香叶醇、橙皮素、橙皮油素和新橙皮苷等7个化合物可作为湘枳壳药材的关键Q-Marker，它们可能通过作用PI3K/AKT和RAS/MAPK信号通路上的PIK3CD、PIK3CB、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、MAPK1、HRAS等关键靶点发挥作用。新橙皮苷可作用于HRAS靶点调控鞘脂代谢通路发挥治疗精神系统疾病及心血管系统疾病的作用；橘皮素可通过AKT、HRAS等靶点介导炎症介质调节、神经信号传导及代谢等通路；柚皮素、橙皮素可通过提高PI3K/AKT信号通路上AKT1蛋白磷酸化活性，调节氧化炎症性损伤等改善小鼠抑郁样行为，同时，橙皮素在多项研究中显示出对血脂调节的潜在效果，通过抑制TGF-β1/ILK/Akt信号通路上的蛋白水平来实现这一作用；柠檬苦素可以抑制TNF-α和IL-6等炎症因子的表达，具有抗炎的药理作用；香叶醇可通过对MAPK信号通路的调节发挥其抗氧化和抗炎作用，诱导癌细胞凋亡。这些Q-Marker的抗氧化、抗炎、降血脂等功效表现为“多组分、多靶点、多通路”的特点。
本研究通过主成分荷载因子从上述Q-Marker中发现柠檬苦素、新橙皮苷、橙皮素、橘皮素和柚皮素等对湘枳壳种质资源样本差异具有较大的功效，但柚皮素和橙皮素含量偏低对分析方法构建形成了较大挑战。进一步的聚类分析发现以柠檬苦素、新橙皮苷、橙皮素、橘皮素、柚皮素、D-柠檬烯、芳樟醇和柚皮苷作为指标成分可实现湘枳壳种质资源的有效区分，部分种质资源呈现出Q-Marker的特异性富集。本文研究用的果实样本均为同一时期嫁接保存在同一地方的盆栽苗，挂果后在同一时期采集的幼果样品，生境和采收时间对样品的影响基本相同。造成标志物特异性富集的可能原因是品种和资源本身品质特性差异；枳壳为酸橙植物的果实，是由橘和柚杂交而来，由于在栽种过程中不是同品种的橘和柚杂交导致的酸橙资源种性差异，从而造成湘枳壳化学谱的差异。
基于这些指标成分建立的高效液相色谱法和顶空固相微萃取-气相色谱法可实现湘枳壳种质资源的筛选及其品质评价，可为湘枳壳质量评价标准的提升及后期深入研究枳壳的药理作用机制及其品种选育提供参考依据。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2024年第12期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：杨 莉,唐 其,范明慧,等.多成分含量测定结合网络药理学识别湘枳壳种质资源品质评价的质量标志物[J].天然产物研究与开发,2024,36:2102-2115. Yang L,Tang Q,Fan MH,et al.Screening of quality markers for the quality evaluation of Hunan Aurantii Fructus germplasm resources based on multicomponent quantitative analysis combined with network pharmacology[J].Nat Prod Res Dev,2024,36:2102-2115.
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