王丽萍1,2 高彩雯1,2 冯海月1,2 曾嵩玉1,2 陈士恩1*
2 西北民族大学生物研究中心 中国-马来西亚国家联合实验室
糖尿病是一种常见疾病，分为1型糖尿病(diabetes mellitus type 1,T1DM)和2型糖尿病(diabetesmellitus type2,T2DM)2种类型，T2DM占糖尿病患者90%以上，主要由胰岛素抵抗、胰岛素分泌异常而导致的餐后血糖升高引起。α-葡萄糖苷酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一，抑制α-葡萄糖苷酶活性已成为控制餐后血糖、治疗T2DM的主要途径。目前临床所用α-葡萄糖苷酶抑制剂多为阿卡波糖、米格列醇等，虽抑制活性较高，但价格昂贵且易引发消化不良等一系列胃肠道反应。植物来源的天然产物因其毒性和副作用小成为治疗剂的优质来源，因此，从天然活性物质中寻找安全、不良反应小的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为研究热点。
红景天作为传统药食同源性中药材之一，含红景天苷、儿茶素、酪醇等多种活性成分，目前国内外研究主要集中于抗缺氧、抗凋亡、抗肿瘤、缓解应激损伤等方面，也有研究表明，其在糖尿病啮齿动物模型中具有一定作用，可通过激活5'-单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)相关信号通路缓解糖尿病小鼠的高血糖、高血脂、尿糖症状。近日研究人员发现红景天提取物可显著降低小鼠的餐后血糖水平，其活性成分在体外表现出一定程度的抑制作用，但具体抑制方式并不明确。我们团队前期研究发现红景天中多酚类物质具有一定体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。基于上述研究背景，本研究结合酶抑制动力学、UHPLC-QE-MS、分子对接技术，以可视化的方式探索红景天提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。研究旨为降血糖药物、保健食品的开发提供理论参考，以期促进红景天的进一步开发利用。
代表性结果
讨论与结论
α-葡萄糖苷酶存在于机体小肠黏膜刷状缘，可将寡糖或二糖分解为单糖，抑制其活性可减缓碳水化合物水解和葡萄糖生成速率，从而降低小肠对葡萄糖的吸收及餐后血糖。研究表明星苹果、象腿蕉、黑枸杞、五味子、紫山药、黔产蒲公英等多种植物提取物均对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。半数抑制浓度(IC50)可以评判抑制剂对酶的抑制效果，IC50越小，抑制活性越高，团队前期研究表明，红景天多酚对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制效果，IC50 2.83mg/mL，本实验所得RCE IC50为1.538mg/mL，不仅低于阿卡波糖，而且低于红景天多酚，这可能是由于RCE中还含有黄酮类、有机酸类等物质。抑制剂对酶的抑制类型可分为可逆抑制与不可逆抑制，本研究所得RCE与α-葡萄糖苷酶为可逆抑制，这种抑制类型特点是抑制物与酶的结合方式为非共价键结合，通过物理方法可使酶恢复活性，可逆抑制类型又可分为4类，分别为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制、混合型抑制，混合型抑制类型有竞争性与非竞争性混合型，该类型特点为抑制物浓度的增加会使酶促反应最大反应速率(Vmax)减小，米氏常数(Km)增大，本研究显示RCE浓度增大后Vmax减小、Km增大，符合上述特点，因此确定RCE对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性与非竞争性的混合型抑制，表明红景天提取物是一种有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂。RCE与红景天多酚、五味子多糖和网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型一致，但需明确哪种化合物属于竞争性抑制，哪种化合物属于非竞争性抑制还需进一步探究。RCE具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但在体内是否效果显著还需进一步动物模型进行验证。目前α-葡萄糖苷酶的来源较多，主要有酿酒酵母、黑曲霉、嗜热脂肪芽孢杆菌、肠膜明串珠菌等。不同来源α-葡萄糖苷酶的性质相差较大，本研究所用α-葡萄糖苷酶为酿酒酵母来源，因此RCE是否对其他来源酶具有相同的抑制效果还需进一步探究。
UHPLC-QE-MS具有快速、准确等特点，可非靶标分析复杂中药材中的化合物，本研究对RCE进行分析，通过与数据库进行对比鉴定出1245种化合物，负离子模式下263种，正离子模式下982种。红景天活性成分提取溶剂主要为乙醇和水，与纯水相比有机溶剂的水溶液可提取出更多化合物，水提物中没食子酸含量高于醇提物，酪醇、绿原酸和单宁含量低于水醇提取物，因此本实验为提取出更多种化合物，以50%乙醇作为溶剂进行RCE提取制备。但由于提取溶剂的单一，检测出的化合物并不一定是红景天全部化合物，还存在部分化合物不能被提取或鉴定，因此还需进一步增加不同提取溶剂的对比实验。Zakharenko研究表明，红景天中主要活性成分为红景天苷、木犀草素、儿茶素、槲皮素、草本素、没食儿茶素等，这与本研究结果较为一致，RCE中具有较高含量的木犀草素、槲皮素。分子对接可预测小分子配体与受体蛋白之间是否可发生结合及结合的作用力，本研究将UHPLC-QE-MS所得20种含量较高的化合物与α-葡萄糖苷酶进行分子对接，结果表明11种化合物可与α-葡萄糖苷酶结合，分别为木犀草素、红景天苷、山奈酚、(-) -epicatechin 3-O-gallate、咖啡酸、L-苹果酸、(+)-表儿茶素、槲皮素、(-)-erythro-anethole glycol 1-glucoside、3-hydroxy-4，6-heptadiyne-1-yl 1-glucoside、酪醇，其中咖啡酸形成氢键最多，可与His-515、Arg-437、Glu-432、His-348残基结合。(+)-表儿茶素与Asn-443和His-515具有最佳的结合活性，结合能最低(-17.08kJ/mol) ; 将PNPG与α-葡萄糖苷酶进行对接，发现Arg-437和Glu-432为其2个结合位点，咖啡酸与PNPG拥有相同的结合位点Arg-437和Glu-432，L-苹果酸、槲皮素和酪醇与PNPG具有相同的结合位点Arg-437，因此推断咖啡酸、L-苹果酸、槲皮素和酪醇对α-葡萄糖苷酶的抑制类型可能为竞争性抑制，其他6种化合物为非竞争性抑制，但如需验证还需进一步将化合物纯化后做Lineweaver-Burk双倒数图，分别确定其抑制类型。
综上所述，本研究通过酶抑制动力学、UHPLCQE-MS、分子对接技术，以可视化的方式探索了RCE对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，抑制类型为竞争性与非竞争性的混合型抑制，RCE中(+)-表儿茶素与α-葡萄糖苷酶结合活性最佳。本文为RCE开发成为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂及红景天资源的开发利用提供了基础研究。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2022年第12期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：王丽萍,高彩雯,冯海月,等.基于分子对接及酶抑制动力学探究红景天提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性[J].天然产物研究与开发,2022,34:2018-2025. Wang LP,Gao CW,Feng HY,et al.In vitro α-glucosidase inhibitory activity of Rhodiola crenulata extract based on molecular docking and enzyme inhibition kinetics[J].Nat Prod Res Dev,2022,34:2018-2025.
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