袁 力1* 纪建华2 李敏艳3
1 汉中职业技术学院临床医学院
2 汉中职业技术学院药学院
3 汉中职业技术学院医学技术学院
前言
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种与肠道菌群失调有关的慢性炎症性肠病。目前，虽然药物治疗(包括5-氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂、生物制剂和益生菌)可缓解症状，但这些治疗受到高复发率和不可避免的副作用(如恶心、呕吐、骨髓抑制、感染和致癌风险)限制。因此，迫切需要开发新型有效的UC疗法。遗传因素、肠道环境、免疫反应、细胞凋亡和感染都与UC有关。据报道，UC患者表现出肠道菌群功能障碍，导致肠道上皮细胞屏障的通透性增加，引发肠道炎症反应；并且在UC进展中，导致炎症的辅助性T细胞17(T helper 17 cells,Th17)通常会增加，而抑制炎症的调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)会减少。通过调节肠道微生物群来调节Th17/Treg平衡可以治疗UC。因此，调节Th17/Treg平衡已成为UC治疗的重要靶点。
木犀草素是一种天然产物，广泛存在于菊花、辣椒、紫苏等多种植物中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等作用。越来越多的证据表明，木犀草素可以减少促炎因子的分泌，如TNF-α和IL-6，从而抑制炎症反应，它已被应用于治疗炎症相关疾病，包括UC。据报道，木犀草素对肠道微生物群有调节作用，可以通过调节肠道微生物群的组成和结构对UC治疗产生有效影响。然而，木犀草素是否能调节UC中Th17/Treg平衡仍不清楚。
Treg与Th17的动态平衡受到多种信号通路的调节，AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路是其重要的调节通路之一。研究显示，通过增强AMPK的磷酸化水平，降低mTOR的磷酸化水平可调节人Th17/Treg细胞分化，而这种作用可被AMPK信号抑制剂 Compound C阻断；在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC大鼠模型中，增强AMPK磷酸化，可使mTOR表达和多种炎性细胞因子水平降低，导致Th17细胞分化减少。沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,SIRT3)是一种抗炎和肿瘤抑制基因，在结肠肿瘤发生过程中与肠道微生物群相互作用，已经被报道SIRT3缺陷小鼠对结肠炎症和肿瘤发展高度敏感。提示，SIRT3可能与UC的进展相关。同时，SIRT3也是AMPK/mTOR通路的上游调节因子，其过表达可上调AMPK磷酸化和下调mTOR磷酸化，抑制炎症。最近的一项研究显示，木犀草素可增加SIRT3表达，通过调节SIRT3/AMPK/mTOR信号通路预防脑缺血再灌注损伤。因此，本研究旨在探讨木犀草素对UC的保护作用是否与 Th17/Treg免疫平衡有关，并对其机制进行分析，以期明确木犀草素对UC的保护作用，并为UC的治疗和木犀草素的应用提供参考。
讨论与结论
近年来，中医药广泛用于UC的治疗。越来越多的研究表明，中医药在UC治疗过程中在调节肠道菌群方面发挥着重要作用。木犀草素是研究最透彻的生物类黄酮之一，类黄酮是一种低毒的天然化合物，到目前为止，它的使用还没有记录到严重的副作用，故木犀草素具有较高的安全性。在本研究中，在体内探究了木犀草素对DSS诱导的UC的影响。我们的结果表明木犀草素对UC有显著影响，这可以通过体重减轻、DAI评分、黏膜坏死和炎症细胞浸润的减少来证明。这与早期的研究一致，再次证实了木犀草素对UC的保护作用。
先前的研究表明，木犀草素可以抑制T细胞介导的自身免疫性疾病中Th17反应；并可通过诱导CD4+CD25-转变为Treg细胞发挥抗炎作用。也有报道称，木犀草素可以抑制UC模型小鼠促炎细胞因子的产生，如TNF-α、IL -1β、IL-6和IL-17；木犀草素衍生物可通过降低Th1、Th2和Th17细胞水平，在DSS诱导的UC模型中发挥体内保护作用。我们进一步研究了木犀草素对Th17/Treg平衡的影响，Th17/Treg失衡是UC进展的重要机制之一。在本研究中，我们发现UC小鼠脾淋巴细胞中Treg细胞的百分比显著降低，Th17细胞的百分比显著增加。提示UC小鼠Th17/Treg比值严重失衡。脾是重要的免疫器官，DSS可诱发UC小鼠的免疫功能紊乱，导致脾代偿性肿大；而木犀草素可降低脾指数，减轻DSS诱发的小鼠结肠炎。本研究进一步证实UC小鼠脾淋巴细胞中存在明显的Th17/Treg失衡，这与人UC一致。
Th17细胞分化过程是在RORγt的转录调控下介导的，Th17细胞产生促炎细胞因子，包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和IL-25，它们有助于UC的进展。Treg的分化受Foxp3调控，成熟的Treg表达高水平的Foxp3。此外，Treg分泌抑制性细胞因子，包括IL-10、IL-35和TGF-β，它们可以抑制适应性和先天免疫反应。研究表明，增加的Th17细胞会产生高水平的IL-17和IL-23，从而促进炎症。然而，Treg的分化被抑制，引发免疫抑制性细胞因子的减少，包括IL-10。改善Th17/Treg失衡有助于重建肠道免疫稳态和降低UC。本研究表明，木犀草素组抗炎细胞因子IL-10升高，促炎细胞因子IL-6、IL-17和IL-23降低；提示，木犀草素干预改善了DSS诱导的UC模型中Th17/Treg失衡，与之前的研究一致；此外，进一步分析表明，木犀草素显著下调了UC小鼠中RORγt，并上调了Foxp3。由于RORγt与Th17细胞分化呈正相关，而Foxp3与Treg细胞分化呈正相关，我们的研究结果进一步说明木犀草素有助于Th17/Treg细胞分化平衡。
Th17/Treg细胞分化受两种主要的营养感应途径AMPK和mTOR调节。SIRT3是一种有效的脱乙酰酶，SIRT3已显示可激活AMPK/mTOR通路促进自噬，而SIRT3缺乏可抑制AMPK/mTOR通路。在本研究中，我们可观察到UC小鼠结肠组织中SIRT3蛋白水平和p-AMPK/AMPK比值显著低于正常小鼠，而p-mTOR/mTOR比值显著高于正常小鼠，表明UC小鼠体内存在SIRT3缺乏现象，AMPK的活化被抑制。木犀草素可通过调节沉默调节蛋白的表达来调节AMPK活性，Liu等人的研究显示，木犀草素可以增加SIRT3的转导，激活SIRT3/AMPK/mTOR通路，减轻脑缺血损伤。由此，我们猜想木犀草素对UC小鼠Th17/Treg平衡的影响可能与SIRT3/AMPK/mTOR通路有关。Western blot结果显示木犀草素可升高UC小鼠结肠组织SIRT3蛋白水平，增强AMPK的磷酸化水平，并下调mTOR磷酸化水平，这证实了我们的猜想。3-TYP是SIRT3的选择性抑制剂，已经被报道可抑制SIRT3表达。在本研究中，为了进一步明确木犀草素对UC小鼠的保护机制，我们在木犀草素干预UC小鼠的基础上联合应用3 -TYP，结果显示，3-TYP可明显抑制AMPK的活化，显著减弱木犀草素对UC小鼠Th17/Treg细胞分化平衡的影响。提示，木犀草素可能通过激活SIRT3/AMPK/mTOR通路促进UC小鼠Th17/Treg平衡。
综上所述，木犀草素可改善DSS诱导的UC小鼠模型中Th17/Treg失衡，其作用机制可能与激活SIRT3/AMPK/mTOR通路有关。本研究初步从Th17/Treg平衡的角度探究了木犀草素对UC小鼠的保护机制，表明木犀草素可能是治疗肠道炎症的有效候选成分，为UC的治疗提供了有前景的治疗方法，并为进一步研究木犀草素改善UC的机制提供了方向。例如， SIRT3/AMPK/mTOR通路调节自噬，木犀草素在UC中的作用是否与自噬有关，在未来的研究中我们将进行深入探索。此外，动物实验是临床前研究的关键环节，在未来的研究中将对木犀草素的毒性和安全性进行深入的分析，为促进药物临床前研究和实现临床转化奠定基础。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2023年第7期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：袁力,纪建华,李敏艳.木犀草素调节SIRT3/AMPK/mTOR信号通路对溃疡性结肠炎小鼠Th17/Treg免疫平衡的影响[J].天然产物研究与开发,2023,35:1144-1153. Yuan L,Ji JH,Li MY,et al.Effect of luteolin on Th17/Treg immune balance in mice with ulcerative colitis by regulating SIRT3/AMPK/mTOR signaling pathway[J].Nat Prod Res Dev,2023,35:1144-1153.
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