苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响- 大数跨境

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苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响

天然产物研究与开发

2023-09-11

导读：本研究从线粒体自噬的角度探讨苍术活性部位对脾虚大鼠的调节作用，阐释其健脾机制。

徐慧颖丁奕辉董昊赵雪岑柏阳才谦*

辽宁中医药大学药学院

前言

脾虚属脏腑辩证中常见之证型，通常表现为消瘦、食欲不振、胃脘痛、胀气、乏力、面色萎蔫、便溏等。脾虚表明机体处于低能量代谢状态，尤其与胃肠功能障碍有关。值得关注的是，线粒体是机体胃肠蠕动的重要能量来源，通过氧化磷酸化以ATP的形式产生能量，是“脾主运化”的重要环节。氧化损伤、营养缺乏等外界刺激易导致线粒体损伤，对此，宿主细胞可启动自噬机制清除损伤的线粒体，维持细胞内的环境稳态。如自噬功能受损不能及时清除损伤的线粒体，可诱导细胞死亡。研究发现，脾虚动物骨骼肌、神经、肝脏、心肌等细胞中均发现线粒体自噬异常。

苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC为菊科多年生草本植物，具有燥湿健脾之功效。《中国药典》规定其基源为菊科植物茅苍术或北苍术的根茎。茅苍术野生资源主要分布于湖北、安徽宣城、江西武宁和陕西汉中等地区，北苍术野生资源主要分布东北、内蒙、河北等地区。传统认为江苏茅山地区的苍术质量最好，为道地药材。在泰国、日本等许多国家，苍术也常用来治疗消化系统疾病。现代药理研究表明，苍术可以调节大鼠血清中胃肠激素水平; 苍术提取物对胃癌细胞(bgc-823和sgc-7901)与幽门螺杆菌的生长均有抑制作用。苍术含有多种类型的化学成分，分别为挥发油、多糖、苷类和低极性非挥发物质。课题组之前研究发现，苍术多糖与正丁醇部位(苷类)对脾虚具有治疗作用，本实验是在此基础上，首次从线粒体自噬的角度对苍术有效部位调节脾虚的作用机制进行探究，旨在为苍术的合理应用奠定基础。

代表性结果

讨论与结论

脾虚的临床诊断一般是依据症状，脾虚病人常会表现食欲减退，脘腹隐痛，倦怠乏力，畏寒肢冷等症状。食欲减退在脾虚动物中表现为体重下降，脘腹隐痛会表现为弓背，倦怠无力则表现为神态萎靡和易疲劳，畏寒则会表现为扎堆蜷缩。本实验中，造模后大鼠消瘦、弓背、神态萎靡以及蜷缩聚堆，这些外观行为变化证明了所建立的脾虚大鼠模型是成功的。

线粒体自噬调控机制复杂，多种信号通路可介导不同种类的自噬过程，PINK1/Parkin通路是线粒体最常见、研究最为成熟的自噬信号通路。PINK1在健康的线粒体中通常是检测不到的，因为PINK1进入线粒体后被膜内水解酶(Parl)切割，随后被清除。如图5所示，当线粒体受损时，由于内膜电位降低，PINK1进入线粒体路径被阻断，不断聚集在线粒体外膜并将parkin募集至受损线粒体。Parkin是一种E3泛素蛋白连接酶，被PINK1激活后能够泛素化受损的线粒体膜蛋白，并被选择性自噬接头蛋白p62所识别，再与自噬体膜上的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)连接，启动自噬，最终降解受损的线粒体。本研究发现，模型组PINK1和Parkin mRNA与蛋白显著增加，表明存在受损的线粒体，PINK1/Parkin通路已经激活，但可能由于自噬功能障碍，受损的线粒体未能被自噬降解。生、麸苍术多糖与正丁醇部位治疗后各组大鼠PINK1和Parkin mRNA与蛋白水平降低，表明一些受损的线粒体已被自噬降解清除。

线粒体自噬受众多自噬相关蛋白严密调控，因此某些关键蛋白的表达常用来判定自噬的强弱，其中较为关键的是LC3和p62等。未发生自噬时，大多数LC3以LC3I的形式存在于细胞质中，当自噬发生时，LC3会经泛素化修饰与自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺结合形成位于自噬体膜表面的LC3II，因此，LC3II的出现常作为自噬发生的重要标志。作为一种关键的选择性自噬适配蛋白，p62可与LC3II结合并作为选择性自噬的底物。当溶酶体与自噬体处于结合阶段时，p62可作为溶酶体的供体，引导自噬体与之结合，形成自噬溶酶体，最后底物被溶酶体内的蛋白水解酶降解，p62随即被一同降解，自噬的发生通常伴随着p62的减少。本研究观察到，模型组LC3II蛋白表达和LC3II/I比值均显著低于空白组，表明脾虚时胃窦组织细胞内的自噬体形成受限。p62 mRNA与蛋白水平上升，提示自噬活性受到抑制。经生、麸苍术多糖与正丁醇部位给药后各组大鼠LC3Ⅰ向LC3II的转化增强，p62 mRNA与蛋白水平下降，提示自噬水平上升。透射电镜结果与之对应，模型组大鼠线粒体结构损伤较重，未见自噬结构，表明自噬功能受损可能导致了受损线粒体的积累。给药后各组大鼠线粒体结构损伤减轻，自噬溶酶体数量增多。因此，我们认为脾虚导致大鼠胃窦组织线粒体自噬功能受损，而生、麸苍术多糖与正丁醇部位给药后促进了自噬的发生。

线粒体自噬受阻通常伴随着活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生，细胞内ROS水平升高将诱导氧化应激。氧化应激攻击线粒体膜，导致膜电位降低、线粒体损伤和功能障碍，进而引发能量生成缺陷、ROS增多，造成恶性循环。受损和功能失调的线粒体被线粒体自噬选择性清除，有助于减少ROS的产生并防止正常细胞的氧化损伤。H2O2是细胞内主要的内源性ROS，几乎可以由所有的氧化应激源产生，并且能够自由扩散进出细胞，造成氧化-抗氧化系统的失衡。因此，本实验通过检测H2O2含量，间接评价ROS水平。研究结果表明，脾虚大鼠体内H2O2水平，膜电位和ATP 降低，表明线粒体功能受损。而生、麸苍术多糖与正丁醇部位的治疗显著改善了线粒体功能，这可能是通过促进线粒体自噬和增加受损线粒体的清除实现的。

综上，我们推测，苍术多糖与正丁醇部位可能是通过改善胃窦组织自噬障碍，恢复线粒体功能，从而调节脾虚，且麸炒后多糖与正丁醇部位效果明显优于生品。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2023年第8期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。

引用格式：徐慧颖,丁奕辉,董昊,等.苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响[J].天然产物研究与开发,2023,35:1372-1379. Xu HY,Ding YH,Dong H,et al.Effects of polysaccharides and n-butanol fractions of Atractylodis Rhizoma on mitophagy in rats with spleen deficiency[J].Nat Prod Res Dev,2023,35:1372-1379.