刘国良1,2 李 丽1 雷 霞2 徐红丹3 张 宁2 姚 远1∗
1 哈尔滨体育学院运动分子生物学实验室
2 黑龙江中医药大学
3 无锡卫生高等职业技术学校
前言
AD是一种进行性的神经退行性疾病，目前影响全球5000多万人，预计将成为老龄化人口的主要问题，给患者、家庭和医疗系统带来巨大负担。AD是最常见的年龄相关性痴呆，约占所有痴呆病例的70％。虽然AD的最终阳性诊断仍需要对脑组织进行死后分析，但已经提出了越来越多的关于脑脊液、血液和正电子发射断层扫描成像生物标记物，并预计结合临床标准和评估，能够提供早期诊断，活体患者的敏感性和特异性诊断。AD的特征是细胞外淀粉样β(Aβ)斑块、由微管稳定蛋白tau的截短和磷酸化形式组成的神经内包涵体(神经原纤维缠结)、营养不良的神经突起、突触和神经元的 缺失，和一个突出的胶质增生，涉及小胶质细胞和星形胶质细胞的形态和功能的改变。近年来血液代谢组学技术已经在AD的疾病诊断及机制研究发明发挥巨大的作用，甚至可以作为筛查AD的特定检测工具。AD的代谢基础知之甚少，代谢系统异常与AD发病机制之间的关系尚不清楚。了解整体代谢紊乱如何与AD神经病理学的严重程度以及AD症状在高危人群中的最终表达相关，对于开发有效的疾病改善治疗至关重要。网络药理学是人工智能和大数据时代药物系统性研究的新兴、交叉、前沿学科，强调从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物及治疗对象之间的分子关联规律，被广泛应用于药物和中药活性化合物发现、整体作用机制阐释、药物组合和方剂配伍规律解析等方面，为中药复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、新药研发等提供了新的科技支撑。因此本研究采用高通量代谢组学结合网络药理学技术对其进行研究，以期发现潜在成分及与疾病相关的核心代谢物，阐明药物的作用机制。
本研究通过代谢组学技术发现15个与AD密切相关的血液生物标记物，其代谢机制及生理学意义不同程上都与AD的发展相关，阐述如下。
机体的学习记忆机制与5-HT等代谢物密切相关。酪氨酸是苯丙氨酸在人和动物体内羟基化产生的一种非必需氨基酸。它是肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等单胺类神经递质的前体。多巴胺通过中脑边缘、中脑皮层、黑质纹状体和结节-漏斗通路调节心理活动、情绪、识别、思维和推理，间接影响记忆。3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸盐、高香草酸均为多巴胺代谢途径系统的代谢产物。在本研究中，模型组大鼠血清中3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸盐和N-乙酰5-羟色胺含量显著高于假手术组，而模型组的高香草酸和香草基扁桃酸的水平低于假手术组。二至丸可调节AD大鼠内源性代谢产物水平(P＜0.05)，提示二至丸可能通过调节单胺类神经递质及其代谢产物水平，增强AD大鼠的学习记忆能力。
神经系统中主要的抑制性氨基酸神经递质γ-氨基丁酸也被认为与认知功能有关。γ-氨基丁酸在维持大脑兴奋平衡和抑制神经传导方面起着重要作用。尸检和动物模型研究表明，在AD的病理过程中存在γ-氨基丁酸能系统功能障碍。4-胍基丁酸是γ-氨基丁酸的前体。在精氨酸酶缺乏症患者中，4-胍基丁酸水平升高导致多种临床综合征，如智力低下、神经发育停滞和癫痫。在本研究中，二至丸降低了AD大鼠血液中4-胍基丁酸的含量，推断增加了海马中的γ-氨基丁酸含量，表明二至丸可以促进γ-氨基丁酸的合成，减少高氨血症对神经系统造成的损伤，从而发挥神经保护作用。
谷氨酸和天冬氨酸是两种主要的兴奋性氨基酸神经递质，在神经系统兴奋性信息的传递中起着重要作用。它们与神经元的存活、突触形成和可塑性有关。谷氨酸和天冬氨酸是突触前膜释放的兴奋性氨基酸，选择性地结合G蛋白介导的谷氨酸受体和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，导致钙通道开放。这增加了突触后膜中Ca2+的内流，并参与突触传递长时程增强(LTP)的产生和维持。LTP被认为是记忆形成和巩固过程中神经元生理活动的指标。模型组甘氨酸、天冬氨酸含量显著升高(P＜0.01)，给药组甘氨酸、天冬氨酸含量显著降低(P＜0.01)。结果表明，二至丸能抑制脑内兴奋性氨基酸的合成，从而对神经细胞起到保护作用。
牛磺酸是一种条件性必需氨基酸，特别分布于大脑皮层、海马和小脑。在中枢神经系统中，牛磺酸作为第二丰富的内源性氨基酸，在神经调节、渗透调节、钙稳态维持、膜稳定、抗氧化功能、抗炎过程和神经保护中发挥作用 。牛磺酸在许多病理条件下也显示出神经保护作用，如AD和亨廷顿病。在AD进展过程中，Aβ单体聚集成神经毒性可溶性寡聚体Aβ，导致认知障碍。据报道，AD患者大脑中的牛磺酸含量降低，牛磺酸可抑制Aβ的积累。此外，牛磺酸对大鼠的智力发育有显著影响。体内注射牛磺酸可以增加大脑中乙酰胆碱的含量，长期使用牛磺酸没有毒性或其他副作用。在本研究中，给予二至丸后，模型组大鼠血液牛磺酸浓度降低，二至丸治疗后显著升高。这一结果表明，二至丸可通过调节牛磺酸代谢抑制Aβ蛋白的积累。
腺苷负责调节、整合和微调神经元活动，并影响相关的大脑功能，包括睡眠和觉醒、认知和记忆以及神经元损伤和退化。尿苷作为膜磷脂生物合成的前体，已被证明可通过减少新生儿早期凋亡细胞死亡来增加脑突触的数量并长期改善学习和记忆。与假手术相比，模型组中的腺苷和尿苷水平显著升高，给药组中的腺苷和尿苷水平远低于模型组。腺苷和尿苷恢复到健康水平可能是二至丸可以通过影响神经元的结构和功能来改善AD大鼠的学习记忆。
色氨酸是人体必需的氨基酸，参与蛋白质和一些重要活性物质(血清素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酸)的合成，犬尿氨酸途径的不平衡与AD有关。犬尿氨酸途径由两个分支组成，导致黄嘌呤酸和犬尿氨酸的形成或3-羟基邻氨基苯甲酸酯和3-甲氧基邻氨基苯甲酸酯的产生。犬尿酸作为N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂被认为具有神经保护作用，而其他分支的代谢产物，包括3-羟基邻氨基苯甲酸和3-甲氧基邻氨基苯甲酸盐被认为具有神经毒性。3-羟基邻氨基苯甲酸和3-甲氧基邻氨基苯甲酸盐的积累可能导致星形胶质细胞和某些神经细胞的凋亡，从而削弱小胶质神经网络的工作，减少神经营养因子的合成，并使整个神经系统受到损伤。二至丸降低AD大鼠尿中3-羟基邻氨基苯甲酸盐的含量，提示二至丸可通过减少神经毒性物质保护神经细胞。
除此之外，有研究表明组织蛋白酶D可能是AD的重要诊断因素。研究对照受试者和认知障碍患者的血浆样本检查了与AD发病机制有关的选定蛋白质水平的变化。为了对疾病进行精确分类，56名参与者接受了临床认知测试、淀粉样蛋白正电子发射断层扫描和磁共振成像评分的白质高信号。通过免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)检查受试者的血浆组织蛋白酶D水平。通过统计分析检查血浆组织蛋白酶D水平与AD相关因素和临床特征的相关性。通过定量免疫印迹和ELISA分析，我们发现与对照组相比，脑部淀粉样斑块沉积组织蛋白酶D(一种主要的溶酶体蛋白酶)的血浆水平降低。血浆组织蛋白酶D水平与临床痴呆评定量表总和评分呈负相关。综合多变量逻辑回归模型表明血浆组织蛋白酶D水平在区分AD和非AD方面具有很高的性能。这些结果表明，血浆组织蛋白酶D水平与AD密切相关，其可以开发为 AD的诊断生物标志物候选物。
引用格式：刘国良,李丽,雷霞,等.基于血清代谢组学和网络药理学研究二至丸抗阿尔茨海默病的作用机制研究[J].天然产物研究与开发,2023,35:1027-1037. Liu GL,Li L,Lei X,et al.Mechanism of Erzhi Pill against Alzheimer's disease based on serum metabolomics and network pharmacology[J].Nat Prod Res Dev,2023,35:1027-1037.
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