王百才1 赵 耀1 耿若愚1 马 冲1 刘天华1 胡君萍1∗ 杨建华1,2∗
２新疆医科大学第一附属医院
肝纤维化是诱发肝硬化甚至肝癌的主要原因，约90％的肝癌是在肝纤维化或肝硬化的基础上发展而来，因此肝纤维化的治疗尤为重要。肝纤维化在临床发病率逐年增加，严重危害了人们的生命安全。肝纤维化的主要原因包括慢性肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝炎。肝纤维化的特征是细胞外基质的过度积聚，这是由细胞外基质的合成和沉积增加以及细胞外基质降解减少或不引起的。肝星状细胞激活被认为是肝纤维化的关键环节，它是肝脏中细胞外基质蛋白过量累积的主要原因。
茴香根皮是伞形科植物茴香Foeniculum vulgare Mill.的干燥根皮，收录在部颁标准维吾尔药分册中，用于治疗湿寒性或黏液质性疾病，如湿寒性各种炎肿，两胁寒痛，腰背酸痛，闭经、闭尿、陈旧性肠梗阻等。护肝布祖热颗粒是民族医药保肝经典方，由芹菜子、芹菜根、菊苣子、菟丝子、菊苣根、茴香根皮、小茴香组成，具有补肝利胆等功效。课题组前期研究发现护肝布祖热颗粒可以保护CCI4诱导的大鼠肝纤维化。麦迪乃·赛福丁等发现民族药茴香根皮具有一定程度的促进肝组织修复并保护肝细胞膜的作用。因此，茴香根皮可能具有抗肝纤维化作用。
药物谱效关系研究是将化学成分与药效研究相结合对有效化学成分进行分析的方法，是在图谱研究的基础上，最大限度地获取有用的化学信息，将谱图与药效结果联系起来，通过线性或非线性数学处理，建立“谱-效”数学模型，从而确定出与药效相关的化合物群。通过对已知成分和未知成分的分析，能最大程度地反映中药复杂混合体系中所含化学成分的种类和含量，进而对中药质量进行整体描述和评价。故本研究采用超高效液相色谱-质谱联用对维药茴香根皮化学成分进行了研究，结合茴香根皮乙醇提取部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水萃余部位对HSC-T6细胞增殖的影响联合UPLC-Orbitrap-MS/MS借助偏最小二乘法及灰色关联分析对茴香根皮化学成分进行筛选，并经体外实验验证茴香根皮有效成分抗肝纤维化的作用及其机制，为民族医药的研究和开发利用提供科学依据。
中药多靶点多成分的协同作用已成为中药研究的热点。药效成分研究是药物研究的基础，其活性成分及作用方式均存在复杂性的特点。2002年，李戎提出谱效关系理论，为中药药效研究指明新的研究方向。本研究在茴香根皮醇提取物和不同萃取物UPLC-Orbitrap-MS/MS图谱共有峰与其抗肝纤维化作用数据量化的基础上，采用偏最小二乘法和灰色关联分析对茴香根皮总离子流图谱共有峰与抗肝纤维化作用的大小进行相关性研究，可较大程度反映成分对药效的贡献作用。
本研究以茴香根皮醇提物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位为研究对象，开展高效液相色谱联用质谱分析，构建茴香根皮液质图谱，正负离子模式共标定了58个共有峰，分析图谱，可见各样品的共有峰面积有差别，可用于谱效关系研究。谱效关系分析有11种成分对抗肝纤维化作用的贡献较大(VIP＞1和回归系数＞0)。其中，已有文献报道具有抗肝纤维化作用的化合物有没食子酸、芹菜素、山柰酚、秦皮乙素、东莨菪内酯和大黄酸等，体现了茴香根皮多成分多靶点发挥抗肝纤维化作用的特点。去氢骆驼蓬碱、二氢辣椒碱和异莨菪亭是首次在茴香根皮中发现含量相对较高且具有较好抗肝纤维化活性的化合物，可能为潜在质量标志物。其中去氢骆 驼 蓬碱可能通过降低肺组织中TGF-β1、Smad3和NF-kB p65的表达改善细粒棘球蚴继发感染引起的小鼠肺组织纤维化。二氢辣椒碱和异莨菪亭抗肝纤维化的研究尚未见报道。
Bcl-2属于抗凋亡基因，是协调细胞生命和死亡的关键因子，Bax属于促凋亡基因，是Bcl-2家族的促凋亡蛋白。caspase3作为细胞凋亡的重要效应因子，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必由之路，其被激活预示着凋亡步入不可逆阶段。在凋亡中，Bax/Bcl-2的比值是衡量细胞经线粒体途径凋亡的重要指标，Bax/Bcl-2比值升高时，凋亡增加；反之，凋亡减少。当细胞感受到凋亡信号后，可以通过调控Bcl-2、Bax等凋亡因子的表达而活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase9)，进而激活Caspase3，引发Caspase家族级联反应，从而诱导细胞凋亡。本研究通过实验证实，去氢骆驼蓬碱、二氢辣椒碱可以降低活化肝星状细胞内线粒体功能并打破线粒体膜电位平衡，使促凋亡因子(Bax)被大量释放，最终导致细胞凋亡，减少肝星状细胞的增殖，抑制细胞外基质和α-平滑肌激动蛋白的表达，从而减轻肝纤维化。在后续的实验中，需要对筛选出的单体化合物进行体内实验验证，在mRNA和蛋白水平上进一步研究茴香根皮单体化合物抗肝纤维化的作用机制。
综上所述，本研究通过采用UPLC-Orbitrap-MS/MS技术联合偏最小二乘法和灰色关联分析阐明了茴香根皮的抗肝纤维化的可能成分，体现了茴香根皮多成分多靶点抗肝纤维化的作用特点，对于明确中药药效物质基础研究和中药质量标准的提升具有重要意义，为进一步了解其作用机制和临床应用提供参考依据。该研究成果发表在《天然产物研究与开发》2024年第3期，欢迎引用(点击左下方“阅读原文”可查看全文)。
引用格式：王百才,赵耀,耿若愚,等.基于谱效关系的茴香根皮抗肝纤维化有效成分筛选及其机制探讨[J].天然产物研究与开发,2023,36:400-414. Wang BC,Zhao Y,Geng RY,et al.Screening on the effective components of Foeniculum vulgare Mill. cortex against liver fibrosis and its mechanism based on spectrum-effect relationship[J].Nat Prod Res Dev,2023,36:400-414.
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