科拓讲堂|干酪乳杆菌Zhang及其相关产品的研究开发- 大数跨境

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益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang 及其相关产品

的研究开发

图1 Lactobacillus casei Zhang 的益生功能

干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang，L.casei Zhang)是内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室研究人员于2001年从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶样品中分离筛选出的1株性能卓越的益生菌。研究人员采用体外实验、动物模型和人体试验对Lactobacillus casei Zhang 的益生功能进行了系统评价(图1)，并利用基因组学、蛋白质组学和转录组学的手段对 Lactobacillus casei Zhang的益生机制进行了深入剖析。经过多年系统的基础研究，自主解决了其产业化的关键技术问题，包括直投式发酵剂、发酵乳制品、发酵豆乳益生菌饮料、益生菌固体饮料、益生菌片剂等产品，并实现了产业化。相关研究开发报告分类目录如下：

1．Lactobacillus casei Zhang的分离与筛选

2．Lactobacillus casei Zhang的益生功能评价

a) Lactobacillus casei Zhang对高脂血症大鼠脂质代谢的影响

b) Lactobacillus casei Zhang对机体抗氧化能力的影响

c) Lactobacillus casei Zhang对肝损伤的改善保护作用

d) Lactobacillus casei Zhang对糖耐量受损改善作用和Ⅱ型糖尿病的预防作用

e) Lactobacillus casei Zhang对病原性大肠杆菌的拮抗作用

f) Lactobacillus casei Zhang的免疫调节作用

g) Lactobacillus casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

h) Lactobacillus casei Zhang在人体肠道中的定植及对肠道菌群的影响

i) Lactobacillus casei Zhang对结肠癌的预防作用

3．Lactobacillus casei Zhang基因组学及蛋白质组学研究

4．Lactobacillus casei Zhang稳定性研究

5．Lactobacillus casei Zhang直投式发酵剂的开发及产业化

6．Lactobacillus casei Zhang在发酵乳制品和发酵豆乳制品中的研究开发及产业化

7．Lactobacillus casei Zhang在益生菌固体饮料、益生菌片剂等健康食品中的研究开发及产业化

8. Lactobacillus casei Zhang研究开发获得的奖励

9．Lactobacillus casei Zhang相关的发明专利和发表的研究论文

Lactobacillus casei Zhang

研究开发摘要

1.Lactobacillus casei Zhang的分离与筛选^[1-10]

Lactobacillus casei Zhang是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶（Komiss）中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌（图2~图7）。酸马奶是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性、低酒精含量乳饮料，在蒙古族中已有几千年的制作和食用历史。几千年的蒙医临床实践表明，酸马奶对胃肠道、心血管和呼吸道疾病具有明显的辅助治疗作用。

Lactobacillus casei Zhang是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库(中国第一个最大的原创性乳酸菌菌种资源库，保藏乳酸菌6,686株)保藏的243株分离自自然发酵酸马奶中的乳杆菌中优选的1株具有优良益生特性的乳杆菌。Lactobacillus casei Zhang在pH2.0的人工胃液中消化3小时后继续在pH8.0的人工肠液中消化24小时后的存活率高达73.5%。

Lactobacillus casei Zhang可耐受的最大胆盐浓度为1.6g/100mL，其对Caco-2细胞的黏附率为4.31%，对牛磺胆酸钠解共轭所产生的游离胆酸量为2.28mM/L。

2.Lactobacillus casei Zhang的益生功能评价

2.1 Lactobacillus casei Zhang对高脂血症大鼠脂质代谢的影响^[11-13]

高脂血症大鼠摄食Lactobacillus casei Zhang(2.0×10⁸CFU/d) 30d后，大鼠血液中的甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量分别下降了31.3%和30.8%；肝脏组织中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量分别下降了20.4%和17.5%(图8)，同时Lactobacillus casei Zhang可以调节血液中载脂蛋白的代谢，并可显著增加粪便中总胆汁酸的排出。这一研究结果表明，Lactobacillus casei Zhang可显著改善高脂血症动物的脂质代谢，具有良好的降血脂作用。利用DNA芯片技术对大鼠肝脏组织的基因表达进行了分析(图9)。结果表明Lactobacillus casei Zhang可以加速脂肪酸的氧化进而促进TG的分解代谢从而起到降血脂的作用。

2.2 Lactobacillus casei Zhang对机体抗氧化能力的影响^[14-15]

用Lactobacillus casei Zhang饲喂大鼠28d (2.0×10⁸ CFU/d)，与对照组相比，Lactobacillus casei Zhang可使大鼠肝脏组织中的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活力极显著提高( P<0.01)，血清谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)水平显著降低(P<0.05)。大鼠肝脏组织中的氧化产物---丙二醛(MDA)浓度极显著降低(P<0.01)。这一结果说明Lactobacillus casei Zhang可提高机体的抗氧化能力（图10）。

2.3 Lactobacillus casei Zhang对肝损伤的改善保护作用^[16-18]

以酒精性肝损伤大鼠为模型的研究结果显示：Lactobacillus casei Zhang可显著降低肝脏中碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)的活性(P<0.01)；同时调节大鼠肝脏组织中CYP3A1/GAPDH、CYP3A2/GAPDH和CYC/GAPDH的基因表达水平，起到保护肝脏的作用(图11)。以脂多糖和D-半乳糖诱发肝损伤（LPS/D-GalN）大鼠为模型的研究结果表明Lactobacillus casei Zhang通过抗氧化和抗炎症的益生特性能够保护由脂多糖和D-半乳糖引起的肝损伤(图12)。

2.4 Lactobacillus casei Zhang对糖耐量受损改善作用和Ⅱ型糖尿病预防作用^[19-20]

采用高果糖水诱导SD大鼠高胰岛素血症合并糖耐量受损来评价益生菌Lactobacillus casei Zhang(1.0×10⁹CFU/d·只)的预防及改善作用。试验结果表明Lactobacillus casei Zhang可以显著预防和改善糖耐量受损，并显著提高肠道乳杆菌和双歧杆菌数量和显著降低肝糖原含量和梭菌数量（P<0.05）。部分数据见图13(正常组-NC、预防组-LP、预防模型组-HMⅠ、治疗组-LT、治疗模型组-HMⅡ)。

以Ⅱ型糖尿病大鼠为模型，对试验大鼠（正常对照组、预防组（从试验前21d开始喂饲Lactobacillus casei Zhang (4.0×10⁹CFU/d)直至试验结束）、Ⅱ型糖尿病模型组）进行了为期42d的试验，试验结果表明：预防组与Ⅱ型糖尿模型组相比空腹血糖和餐后2小时血糖水平都明显降低(P<0.01)，而且预防组的糖耐量水平与模型组相比也得到显著改善(P<0.01)。Lactobacillus casei Zhang可以显著降低血液中内毒素和总胆汁酸水平(P<0.05)，显著降低诱导型NO合成酶（INOS）活性(P<0.05)。起到预防Ⅱ型糖尿病的作用，试验数据见图14、图15。

益生菌Lactobacillus casei Zhang可以对糖耐量受损大鼠口服糖耐量曲线AUC表现出良好的预防和改善作用，同时对大鼠Ⅱ型糖尿病有着良好的预防作用（图16）。但具体机制存在一定差异。对糖耐量受损的预防机制主要可能是Lactobacillus casei Zhang可以减少肠道对大量果糖的吸收以及降低GLP-2水平从而降低体重和胰岛素水平。而对糖耐量受损的治疗改善机制主要可能是摄入Lactobacillus casei Zhang可以保持肠道中较高数量的维生素K2主要产生菌Bacteroides fragilis，这样可以增加骨钙素水平，从而改善口服糖耐量水平。

研究发现Lactobacillus casei Zhang可以预防氯离子的丢失并上调氯离子相关基因的表达。同时，盲肠菌群发生改变，尤其是胆汁酸7α羧化菌的降低以及粪便胆汁酸组成也发生变化。这些改变与器官组织氯离子的内流相一致。Lactobacillus casei Zhang对Ⅱ型糖尿病及相关并发症的预防机制主要可能是Lactobacillus casei Zhang可以减少7α脱羟基活性肠道细菌的数量，这样增加粪便总胆汁酸水平，进而促成体内胆汁酸与氯离子的交换，从而发生各器官氯离子的内流以及氯相关蛋白表达的增加，整体上增强了大鼠体质和免疫水平(图17)。

2.5 Lactobacillus casei Zhang对病原性大肠杆菌的拮抗作用^[21-23]

用Lactobacillus casei Zhang饲喂小鼠15d(4.0×10⁷CFU/d)，然后分别用E.coli O157和E.coli K88对小鼠进行攻毒，试验结果表明，摄食Lactobacillus casei Zhang可以使攻毒后小鼠的存活率由33.4%提高至 94.4%(图18)，可以在小鼠肠道内定植并能起到拮抗病原菌的作用。

2.6 Lactobacillus casei Zhang 的免疫调节作用^[24-31]

用Lactobacillus casei Zhang喂饲小鼠15d(低剂量组（L dose）：2.5×10⁸ CFU/d、中剂量组（M dose）：5.0×10⁸ CFU/d、高剂量组（H dose）：1.0×10⁹ CFU/d)，研究结果表明：Lactobacillus casei Zhang对小鼠的细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。

Lactobacillus casei Zhang能够通过增加巨噬细胞中Toll受体的表达、增强促炎调节因子的分泌以及Ⅰ型干扰素的分泌，进而保持先天免疫系统的敏感性。部分数据见图19。

2.7 Lactobacillus casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响^[32-35]

以H22荷肝癌瘤小鼠为模型，用Lactobacillus casei Zhang喂饲小鼠12d的试验结果表明Lactobacillus casei Zhang菌体对H22移植性肿瘤的生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为40.22% (P<0.01)，部分试验数据见图20。

实验组H22肿瘤细胞癌基因Bcl-2蛋白表达明显降低，而抑癌基因Bax蛋白表达增强，与荷瘤对照组相比差异显著(P<0.01)。Lactobacillus casei Zhang抗肿瘤机制可能是通过增强荷瘤小鼠免疫功能及同时促进肿瘤细胞Bax蛋白表达、抑制Bcl-2表达以及诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤的作用(图21)。

2.8 Lactobacillus casei Zhang在人体肠道中的定植及对肠道菌群的影响^[36-38]

为了评估Lactobacillus casei Zhang对人肠道菌群多样性的影响，本研究征集了24名健康志愿者评价该菌株在人体肠道的存活定植以及对人体肠道菌群多样性的影响。结果表明，食用Lactobacillus casei Zhang 28天时，Lactobacillus casei Zhang在志愿者粪便中平均含量为3.55×10⁸CFU/g，停止食用2周时为3.31×10⁵CFU/g，这说明Lactobacillus casei Zhang不仅可以在人体肠道中存活，而且可以在人体肠道中定植并繁殖。中年人服用Lactobacillus casei Zhang后肠道菌群结构趋向于青年人的肠道菌群结构（P<0.001），此结果说明服用Lactobacillus casei Zhang可以使肠道菌群结构年轻化（图22）。

焦磷酸测序结果也表明：食用Lactobacillus casei Zhang后人体肠道内有益菌群(Bifidobacterium和Lactobacillus)数量显著增加，而致病菌以及潜在致病菌(Clostridium，Escherichia和Serratia)数量有效减少，使肠道菌群趋于健康化 (图23)。

2.9 Lactobacillus casei Zhang对结肠癌的预防作用

以AOM（azoxymethane,氧化偶氮甲烷，12mg/kg BW,腹腔注射）/DSS(dextran sulphate sodium,硫酸葡聚糖钠，2.5%饮水）炎症性肠癌小鼠为模型，实验分为正常对照组（NC），结肠癌模型组（CC）和益生菌 L. casei Zhang组（ZA），益生菌从AOM注射3天后开始干预直到实验结束（剂量4.0×10⁹CFU/d·只）。结果显示：摄食Lactobacillus casei Zhang可以减少AOM/DSS肠癌小鼠的肠道肿瘤数量、延缓肿瘤的变大。显著增加了与抑制癌变相关的血清脂联素和血清骨钙素水平。显著减少了肠道上皮的异常增殖，降低了肠道肿瘤病理学分数，并延缓肿瘤的形成和癌瘤的严重程度。结肠癌小鼠短链脂肪酸水平乙酸、丁酸显著降低，Lactobacillus casei Zhang干预显著增加了盲肠丁酸的含量，正常组与模型组相比，Helicobacter apodemus （高山姬鼠螺杆菌）, Helicobacter mesocricetorum （仓鼠螺杆菌）,Ruminococcus lactaris （瘤胃球菌）和 Adlercreutzia equolifaciens菌显著降低，可能是结肠癌的潜在致病菌较均有显著提高(P<0.01)；而在健康组丰度较高的 Oscillibacter valericigenes（颤杆菌）和 Bacteroides rodentium (啮齿类拟杆菌)可能是抑制结肠癌发生发展的潜在益生菌。

益生菌Lactobacillus casei Zhang干预下肝脏和肠粘膜的CLCN3表达均显著上调，进一步验证了抗炎通路的激活，这也是益生菌可以激活氯离子通道3来抵抗结肠癌发展的新机制。部分试验结果见图24-26。

3. Lactobacillus casei Zhang基因组学及蛋白质组学研究^[39-53]

3.1 Lactobacillus casei Zhang基因组学研究

2008年，采用全基因组鸟枪法测定 Lactobacillus casei Zhang全基因组序列并进行了功能基因组学分析。该菌株的基因组由 1条染色体(GenBank登录号：CP001084)和1个质粒 plca36(GenBank登录号：CP000935)组成（图27）。该菌株是我国第1株完成全基因组测序的乳酸菌，标志着我国益生乳酸菌的研究进入了基因组时代。2014年课题组应用PacBio SMRT系统完成了益生菌Lactobacillus casei Zhang甲基化图谱的破译工作。通过SMRT分析，我们在L.casei Zhang基因组中发现了N6-甲基腺嘌呤（6mA）甲基化模式，并指定了该菌株中介导这些甲基化模式的DNA甲基转移酶。生物信息学分析显示：L.casei Zhang菌编码两个甲基化转移酶，其中一个有特定的识别位点，暗示其潜在的生物学活性。L.casei Zhang菌中含有一个具有活性的甲基化转移酶。表观遗传学分析结果显示，L.casei Zhang菌中存在1906个甲基化位点。

3.2 Lactobacillus casei Zhang蛋白质组学研究

利用双向电泳技术在国际上首次建立了干酪乳杆菌不同生长时期蛋白质表达图谱 (图28)。

利用蛋白质组研究技术对Lactobacillus casei Zhang在酸和胆盐胁迫下差异表达蛋白质进行了研究。结果表明，该菌株应对胆盐和酸胁迫环境可能有共同的调控机制（图29）

4．Lactobacillus casei Zhang稳定性研究^[54]

将益生菌Lactobacillus casei Zhang在普通MRS培养基中连续传代1000代。实验结果表明，连续传1000代后，Lactobacillus casei Zhang细胞形态与原始菌株相比没有发生变化；活菌数与浊度基本维持不变；菌株活力在传代过程中呈波动性变化，但差异不显著（P>0.05）。以上研究表明益生菌Lactobacillus casei Zhang具有良好的稳定性。

5. Lactobacillus casei Zhang直投式发酵剂的开发及产业化^[55-64]

采用RT-PCR技术系统地研究了Lactobacillus casei Zhang在不同发酵条件和发酵不同阶段 16个关键酶基因表达模式的变化，建立了Lactobacillus casei Zhang在高密度发酵过程中的代谢分子机制（图30）。根据Lactobacillus casei Zhang的代谢分子机制和营养需求，确定了高密度发酵工艺，发酵液活菌数大于 2.0×10¹⁰CFU/mL(图31)。

抗冷冻方面的研究中，发现冷冻干燥过程中糖类的添加对 Lactobacillus casei Zhang细胞膜的zeta电位、疏水性、流动性和完整性均有不同程度的影响，在此基础上开发出了适合Lactobacillus casei Zhang冷冻干燥过程中有效的抗冻保护剂。

基于上述研究，Lactobacillus casei Zhang 经真空冷冻干燥可得到活菌数 2.0×10¹¹CFU/g以上的高活力益生菌粉，可以满足益生菌制剂和各类发酵制品的要求（图32，33）。

6. Lactobacillus casei Zhang在发酵乳制品和发酵豆乳制品中的研究开发及产业化^[65-87]

6.1 Lactobacillus casei Zhang在牛乳和豆乳中的发酵及贮藏特性的研究

将Lactobacillus casei Zhang按1.0×10⁷CFU/mL接种量接种于牛乳中，结果显示，贮藏28天后其活菌数可保持1.0×10⁸CFU/mL以上，发酵乳具有良好的口感和风味；并且，Lactobacillus casei Zhang可以有效抑制霉菌和酵母菌对发酵乳的后期污染（图34）。

将Lactobacillus casei Zhang按1.0×10⁷CFU/mL接种量接种于豆乳中，4℃贮藏28天期间，Lactobacillus casei Zhang的活菌数仍保持在1.0×10⁹CFU/mL，活菌数无明显降低（P＞0.01）。这一结果说明豆乳更加适合Lactobacillus casei Zhang的生长。蛋白质组学分析表明：Lactobacillus casei Zhang在豆乳中生长，较牛乳共有144个差异表达蛋白点，其中迟滞生长期34个，对数生长期64个，稳定生长期46个，三个时期表达上调控蛋白点分别为24个、34个和33个，编码这些表达上调控蛋白质的基因主要参与氨基酸和核苷酸的转运和代谢（图35）。

进一步分析表明：Lactobacillus casei Zhang在牛乳生长过程中，主要上调控基因与PTC系统和磷酸戊糖途径PPP相关；而在豆乳生长过程中，主要上调控基因与蛋白水解酶系统、氨基酸和核苷酸代谢相关，尤其是蛋白水解酶系统的活跃表达，使得Lactobacillus casei Zhang在豆乳能够分解大豆蛋白质为自身的生长提供充足氨基酸和核苷酸，这可能是其在豆乳中生长优于牛乳的主要原因。

将Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9分别以5.0×10⁶CFU/g接种量与酸乳基础发酵剂共同接种于牛乳中。结果显示，4℃下贮藏21天期间，Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9的添加对发酵乳的pH值、滴定酸度(TA)、黏度和持水性基本无影响；Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9在发酵乳中存活稳定； Lactobacillus casei Zhang有改善发酵乳的气味和风味。

6.2 Lactobacillus casei Zhang发酵豆乳饮料、发酵乳及活性乳酸菌饮料中的产业化应用

在青岛君益食品有限公司投产，产品中活菌（Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9）达到 580亿CFU/100mL，是目前我国市场上益生菌饮料中最高活菌数的5倍，且在货架期内活菌数一直保持不变，产品见图36。

7. Lactobacillus casei Zhang在益生菌固体饮料、益生菌片剂等健康食品中的应用与产业化

旗帜婴儿乳品股份有限公司2015年推出了含有Lactobacillus casei Zhang和
Bifidobacterium lactis V9的中老年奶粉(含Lactobacillus casei Zhang高达100亿CFU/100g)，产品见图37。将市场产品于25℃恒温贮藏60d后，Lactobacillus casei Zhang 存活率为82.5%，具有良好的贮存稳定性。

北京和美科健生物技术有限责任公司推出了含有Lactobacillus casei Zhang的复合益生菌片—益生和美(含L.casei Zhang含量大于1000亿CFU/100g)，此外还陆续开发出含有L.casei Zhang的复合益生菌酸奶发酵剂和益生菌粉剂（图38）。

北京灵君康美生物科技有限公司陆续推出了含有Lactobacillus casei Zhang的超级益生菌组合—LA片剂(含Lactobacillus casei Zhang高达1000亿CFU/100g)和LA固体饮料(含Lactobacillus casei Zhang高达2500亿CFU/100g)，产品见图39。

2015年推出了针对不同个体肠道菌群的益生菌私人定制服务，“益生菌私人定制”是一种通过粪便系统分析人体肠道菌群环境，专属定制适合顾客的肠道有益菌群，从而达到肠道和机体健康化、年轻化的益生菌补充方式（图40），图41所示为含有Lactobacillus casei Zhang的私人定制产品。

由北京乐纯悠品商贸有限公司开发的风靡网络的乐纯酸奶，采用含有
Lactobacillus casei Zhang的益生菌发酵剂，产品见图42。

新加坡华盈科技有限公司采用益生乳酸菌L.casei Zhang、B.lactis V9和
L.plantarum P-8开发出各类保健品和健康食品，产品见图43。

8. Lactobacilluscasei Zhang研究开发获得的奖励

(1) 2009年，“功能性益生乳酸菌高效筛选及应用关键技术”获国家科技进步二等奖（证书号：2009-J-251-2-10-D04），证书见图71。

(2) 2011年，“益生菌Lactobacillus casei Zhang从基础研究到产业化开发”获教育部高等学校科技进步二等奖（证书号：2011-249），证书见图72。

(3) 2010年，“益生菌Lactobacillus casei Zhang的筛选及基因组学和蛋白质组学的研究”获内蒙古自治区自然科学一等奖（证书号：2009-Z-001-1-01-D1），证书见图73。

(4) 2009年，“益生菌Lactobacillus casei Zhang基因组学和蛋白质组学的研究”获第六届大北农科技成果奖（国家奖社字第0149号），证书见图73。

9. 发表的研究论文（其中SCI收录37篇，截止到2016年5月）：