HBV pgRNA标准化定量检测方法的建立- 大数跨境

国际肝病

2022-08-10

片警微述评

自我们团队2016年首次阐明慢性HBV感染者血清中的HBV RNA为包裹在核衣壳内的未经逆转录或逆转录不完全的HBV pgRNA，可作为NAs治疗下HBV DNA因被抑制无法检测后反映患者肝组织cccDNA水平，从而可用于预测患者安全NAs停药以来，血清HBV pgRNA作为反映cccDNA转录活性的替代标志物受到了广泛关注，并已写入欧洲和我国的肝病指南、也被美国FDA推荐为抗乙肝病毒新药研发的参考评判指标。然而，对于CHB患者血清HBV RNA的定量检测，由于缺少标准化的检测方法和可用于溯源的标准参比品，一定程度上影响了诊断试剂的开发和临床应用。

在中国食品药品检定研究院颁布人血清HBV RNA标准物质的基础上，我们团队建立了用于检测preC/C-RNA（preC/C区HBV pgRNA）、SF-RNA（非剪接形式的pgRNA）和XR-RNA（X区未经降解而保留的pgRNA）区域的定量体系，通过HBV RNA国家标准物质评估了HBV RNA检测体系的准确性和敏感性，并进而分别在未经治和经短期、长期NAs抗病毒治疗的三个回顾性队列中比较分析了血清pgRNA剪接体和3’端截短体的动态变化趋势及其对HBV RNA定量检测的影响。研究证实，CHB患者血清中存在高比例的pgRNA剪接体和3’末端截短体，并显著影响未经治和经NAs治疗的CHB患者血清HBV RNA的定量检测。因此，慢性HBV感染者，特别于长期NAs治疗的CHB患者，血清HBV RNA定量检测体系的引物和探针均应设计在HBV基因组的5’末端区域，并位于pgRNA的常见剪接供体位点之前，以获得更高的准确性和灵敏度。这一点也被写入了中华医学会肝病学分会基础医学与实验诊断协作组组织制定的《慢性HBV感染者血清HBV RNA检测及临床应用的专家共识》中。

我国是曾经的肝炎大国，慢性HBV 感染者曾经占到国人的十分之一之多。但遗憾的是，无论是乙肝五项、还是HBV DNA定量，既往无一病毒学指标以及检测技术是由我国首次发现并建立的。但血清HBV pgRNA是个转折，我们团队率先阐明了来源、存在形式及其作为反映cccDNA转录活性替代指标的临床应用价值，并率先申报了世界上首个相关专利并获得授权。回想当年，带着对国际乙肝诊断试剂巨头的尊敬，在我们启动血清HBV pgRNA研究不久，就先后与来访的罗氏和雅培诊断的科学家交流了我们对血清HBV RNA的认识和想法，并探讨合作研发的可能性，其中还与后者签署了CDA。尽管后来他们似乎并未与我们、也未与大陆的任何团队合作研发，我们国家却研发出了第一个获批临床使用的血清HBV pgRNA 检测试剂、出台了第一个临床应用专家共识。这些“第一”，使我们这些从事乙肝相关标识发现和诊断试剂研发的专家学者和企业研发人员能够于心无愧。

下面介绍的本实验室联合了多个团队的研究论文，在课题推进中得到了中检院周诚实验室、佑安医院段钟平、郑素军团队、南方医科大学附属南方医院彭劼等团队以及国内多个诊断试剂企业的大力协助，和国家“传染病防治科技重大专项”的连续支持。在文稿投稿过程中也得到了《Emerg Microbes Infect》编辑部和审稿者的帮助和建议。实际上，该文题目“A standardized assay for the quantitative detection of serum HBV RNA in chronic hepatitis B patients”也是在reviewer的建议下在正式online时修改采用的。但我们知道，我们建立的方法是否为一标准化的assay，还需更多的来自国际上不同团队的大规模验证。

写在最后，很高兴该文的第一作者于广鑫博士留在我们团队做博后，期待他能茁壮成长，研发和建立更多的诊断技术和产品。

‍1、建立特异性量化HBV pgRNA剪接体和截短体的检测方法‍

抗病毒治疗特别是核苷（酸）类药物（NAs）治疗是否会带来CHB患者血清HBV pgRNA剪接变异体和截短体的变化从而影响对其定量检测的准确性仍有待明确，本研究检测了患者治疗前后血清pgRNA的动态变化，并通过三种RT-qPCR检测体系的设计评价了HBV pgRNA剪接变异体和3’端截短体对血清HBV RNA定量的影响。

图1 A中的SP1-3为既往文献报道通过巢式PCR检测出的血清中含量最高的剪接变异体类型，其剪切供体位点均为2447位点。根据C基因型HBV基因组序列，我们将preC/C-RNA扩增区域设计在2299-2391区段，只有少数几种如SP5、SP6、SP7和SP12等丰度极低的剪接变异体位于该位点之前，从而避免了绝大多数常见剪接体的干扰。因此，preC/C-RNA在一定程度上可代表血清总HBV RNA的水平；SF-RNA扩增区域为2299-2483区段，上游引物及探针与preC/C-RNA相同，而下游引物则后移92 nt并位于几乎所有剪接变异体缺失区域内，这导致SF-RNA检测体系只能扩增非剪接形式的HBV RNA；XR-RNA扩增区域为1577-1702区段，设计上选取了尽量靠近逆转录起始处DR1区（位于1824-1834区段）附近的保守区域，因此该XR-RNA检测体系可以检测到X区仍然存在的pgRNA。需要注意的是，由于绝大多数3’末端截短体由于其靠近DR1附近的序列会在逆转录过程中被P蛋白的RNase H活性降解，从而无法被XR-RNA检测。理论上，preC/C-RNA和SF-RNA的定量差值可以代表血清中供体位点位于2447位点处的剪接体含量，而pgRNA因逆转录而被降解的3’端截短体含量也可以大致由preC/C-RNA和XR-RNA的定量差值计算得出。

图1. PreC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA检测区域在HBV基因组上的分布

首先，我们利用1.2×HBV DNA质粒和通过体外转录得到全长3.5 kb pgRNA进行标准曲线的绘制和可比性质控，验证了上述三种检测体系具有近乎一致的扩增效能，相互间具备可比性（图2）。

图2. preC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA扩增效率评价

2、HBV RNA国家标准品验证三种检测体系的准确性和灵敏度

乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品（以下称HBV RNA国家标准品）来源于RNA阳性的慢性HBV感染者的血浆，由中国食品药品检定研究院惠赠，用于HBV RNA检测试剂盒的质量评价和控制。利用HBV RNA国家标准物质对三组体系的准确性和检测下限进行评估的结果显示，以靶向preC/C-RNA区域的检测体系定量的HBV RNA水平最接近HBV RNA国家标准的真实浓度（图3 A）。进一步将HBV RNA国家标准品进行梯度稀释以评价三种体系的灵敏度，对各个浓度的HBV RNA国家标准品进行20次重复测量，以满足95%检出阳性率的最低检测浓度界定检测下限。结果显示preC/C-RNA区HBV RNA定量检测体系具有最高的灵敏度，SF-RNA次之，而XR-RNA区域检测灵敏度最低（图3 B）。

图3. 国家标准品评价preC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA检测体系的精确性和灵敏度。

3、HBV pgRNA剪接变异体和3’末端截短体可显著影响未经治慢性HBV感染者血清 HBV RNA 的定量检测

前面提到，PreC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA三种检测体系在对HBV RNA国家标准物质的定量检测中已经展现出明显不同的精确性和灵敏度。为了进一步探究不同疾病状态下血清pgRNA剪接体和截短体对HBV RNA定量检测的干扰，我们首先对35名未接受抗病毒治疗的慢性HBV感染者血清HBV RNA水平进行定量检测。结果显示，无论是HBeAg阳性还是阴性状态的患者， preC/C-RNA的定量水平均显著高于SF-RNA和XR-RNA（图4 A）。Bland Altman分析显示，preC/C-RNA和SF-RNA以及XR-RNA之间的结果偏倚分别为0.39 (0.14-0.64) log10 copies/mL和0.63 (0.22-1.04) log10 copies/mL（图4 C）。此外，PCR和测序分析证实，6名HBV RNA处于较高水平的慢性HBV感染者血清中除了存在未剪接的pgRNA外，也同时存在着相当数量的pgRNA剪接变异体（SP1），这进一步支持pgRNA剪接变异体可能影响血清 HBV RNA的定量检测(图4 D,E)。

图4. 未经治的慢性HBV感染者血清中preC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA区域检测结果的对比分析

4、在NAs经治的CHB患者中，HBV pgRNA剪接变异体和3’末端截短体同样可影响患者的血清HBV RNA定量

我们首先纳入了52名接受NAs治疗48周的CHB患者队列，并用上述三个体系定量检测了患者基线及NAs治疗后12、24和48周的血清HBV pgRNA。结果一如预期，preC/C-RNA水平均显著高于SF-RNA和XR-RNA（图5 A）。Bland Altman分析显示，在preC/C-RNA和SF-RNA以及XR-RNA检测结果之间的偏倚分别为0.39(0.09-0.69) log10 copies/mL和0.43(-0.12-0.98) log10 copies/mL（图5 B,C）。此外，根据NAs治疗后48周血清HBV RNA水平的下降幅度，将CHB患者分为快速下降组（≥2 log）和缓慢下降组（<2 log）。两组中preC/C-RNA水平仍均显著高于SF-RNA和XR-RNA（图5 D,E）。

接下来，我们又纳入了一项接受NAs治疗＞5年的CHB患者队列的系列血清。与上述短期治疗队列结果一致，这些接受长期NAs治疗的CHB患者血清中preC/C-RNA水平仍显著高于 SF-RNA 和 XR-RNA（图5 F）。NAs治疗后0、24周、48周、2年、3年、4年和5年，pgRNA剪接变异体占总HBV RNA的平均比例分别为39.75%、36.31%、36.93%、42.95%、45.22%、53.03%和50.99%。同时，X区降解的3’末端截短体占血清总HBV RNA的平均比例分别为68.81%、33.05%、33.12%、56.32%、54.20%、69.69%和57.80%。以上结果提示我们应更加关注长期NAs治疗下pgRNA剪接变异体和3’末端截短体对HBV RNA检测的影响。此外，部分CHB患者在SF-RNA和XR-RNA区域检测到的血清HBV RNA低于检测下限的时间早于preC/C-RNA区域，说明在NAs抗病毒治疗下，preC/C-RNA检测体系不仅拥有最高的灵敏度，并且可以降低假阴性率（图5 G）。

图5. 经NAs抗病毒治疗的CHB患者血清中preC/C-RNA、SF-RNA和XR-RNA区域检测结果的对比分析

总结/讨论

既往研究虽然已经证明血清HBV RNA主要由全长、剪接变异体和3’末端截短的pgRNA组成，但不同HBV RNA异质体的动态变化及其对血清HBV RNA定量检测的影响尚未得到阐明。本研究首先证实，无论HBeAg状态如何、接受NAs治疗与否，pgRNA剪接变异体和3’末端截短体占总pgRNA的比例均足以影响血清HBV RNA的定量检测。由于pgRNA剪接变体和3’末端截短体的比例都可以随着NAs治疗的延长而相对增加，因此在长期NAs治疗下它们对血清HBV RNA 定量检测的影响也会愈加显著。因此，慢性HBV感染者，特别于长期NAs治疗的CHB患者，血清HBV RNA定量检测体系的引物和探针应设计在HBV基因组的5’末端区域，并位于pgRNA的常见剪接供体位点之前，以获得更高的准确性和灵敏度。

文献来源：

Yu G, Chen R, Zheng S, Liu Y, Zou J, Gu Z, Jiang B, Gao Q, Dai L, Peng J, Wang J, Lu F. A standardized assay for the quantitative detection of serum HBV RNA in chronic hepatitis B patients. Emerg Microbes Infect. 2022 Dec;11(1):775-785. doi: 10.1080/22221751.2022.2045874. PMID: 35220917;

（来源：片警实验室）

【声明】内容源于网络

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