肝癌是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌（HCC）作为最常见的原发性肝癌，早期发现可通过手术或移植有效治疗，但多数患者确诊时已进入晚期，治疗效果大打折扣。尽管MRI和增强CT已被广泛使用，但它们主要提供解剖信息，在早期肝癌检测方面存在灵敏度和特异性不足的问题。因此，开发高精度、高灵敏的新型影像方法迫在眉睫。

近年来，分子影像技术尤其是正电子发射断层扫描（PET）在肿瘤精准诊断中显示出巨大潜力。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为一种细胞表面蛋白，在HCC中高度表达，而在正常肝组织中几乎不出现，使其成为理想的诊断与治疗靶点。

尽管已有多种靶向GPC3的分子探针进入研究阶段，例如单抗类、纳米抗体类及肽类探针，但它们仍存在一些局限性：比如血液清除慢、肿瘤摄取低、肾脏残留高或成像对比度差等。为此，我们团队设计并开发了一种新型PET分子探针——[¹⁸F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P，该探针结合了靶向肽、白蛋白结合单元和放射性标记基团，旨在提升成像效果和诊断准确性。

探针设计亮点：

本探针引入4-(对碘苯基)丁酸（IPB）作为白蛋白结合域，显著延长了在血液中的循环时间，增加其在肿瘤部位的富集，同时减少肾脏的非特异性摄取。结构包括三部分：GPC3特异性结合肽、NOTA螯合剂用于载带放射性核素¹⁸F，以及IPB模块。

图1.[18F]AlF-GP2633(A)和[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P (B)的结构，以及[ 18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P (C)的合成。

临床前实验结果令人振奋：

高亲和性与特异性：在GPC3高表达的Huh7细胞中，探针摄取显著高于低表达GPC3的PC3细胞。竞争性实验进一步证实其结合特异性。

图2.(A)Huh7和PC3细胞在不同时间点对[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的体外摄取研究。[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在Huh7（GPC3阳性）细胞中的摄取量随时间推移逐渐增加，而在PC3（GPC3阴性）细胞中则显著降低，这表明其对GPC3具有特异性。

(B)Huh7细胞中[18F]AlFNOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633在不同时间点的体外摄取对比，相较于[18F]AlFGP2633，[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在不同时间点的Huh7细胞摄取量均超过两倍。

(C)Huh7细胞中[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在60分钟后的阻断实验，在阻断实验中，加入GP2633肽后，Huh7细胞对[18F]AlF-NOTA-IPBGPC3P的摄取量从12.53±0.90%ID/1百万细胞显著降至7.38±0.33%ID/1百万细胞，进一步证实了其对GPC3的特异性。

(D)Huh7细胞在不同时间点孵育后，[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633的内化情况。[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在2小时内表现出约81%的内化率，而[18F]AlF-GP2633随时间推移表现出逐渐降低的内化率。

与旧版探针[¹⁸F]AlF-GP2633相比，新探针在肿瘤中的摄取更高、滞留时间更长，60分钟和120分钟时的摄取值分别为4.66±0.22%ID/g和5.05±0.23%ID/g，显著优于对照。

新探针在肿瘤与肌肉、肿瘤与肝脏的比值均明显提高，有助于更清晰区分肿瘤与周围组织。

放射化学纯度与摩尔活性均满足显像要求，且在血液及体内环境中保持稳定。

在原位肝癌模型中也显示出高对比度摄取，与皮下模型结果一致，验证其临床转化潜力。

图3.胸腺裸鼠Huh7异种移植瘤中[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3Por与[18F]AlF-GP2633的动态显微PET成像。

（A-C）阳性对照组(Huh7，A）、阴性对照组(PC3，B）及阻断对照组(C)静脉注射[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P后30、60、90和120分钟的最大强度投影（MIP）图像。

该示踪剂在120分钟内表现出显著增强的肿瘤摄取能力和稳定的肿瘤滞留效果。[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在整个小动物PET成像过程中对PC3肿瘤的摄取始终较低（30、60、90和120分钟时分别为1.75±0.15%、1.65±0.08%、1.55±0.07%和1.56±0.10%）（图3B)，导致肿瘤背景比相应降低，使得PC3肿瘤无法被检测到。此外，已知能靶向GPC3的GP2633可有效抑制Huh7肿瘤中[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的摄取。

(D)Huh7异种移植瘤静脉注射[18F]AlF-GP2633后30、60、90和120分钟的MIP图像。

（E-F）Huh7异种移植瘤静脉注射[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633后的肿瘤摄取时间-活性曲线。

（G-I）Huh7异种移植瘤静脉注射[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633后的肿瘤摄取时间-活性曲线及肿瘤-器官（肌肉和肝脏）比值变化。

[18F]AlF-GP2633在120分钟内表现出较低的肿瘤摄取量且洗脱速度较快；而[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在120分钟内的肿瘤摄取量显著高于[18F]AlF-GP2633（60分钟时分别为4.66±0.22%ID/g与0.72±0.09 %ID/g，p<0.001；120分钟时分别为5.05±0.23 % ID/g与0.35±0.08%ID/g，p<0.001）。

尽管[18F]AlF-GP2633在多数正常器官中的摄取量低于[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P（肾脏除外），但其肿瘤摄取量更低，导致肿瘤背景比值更小。[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的肿瘤-肌肉比（T/M）（60分钟时分别为5.30±1.07与1.61±0.12，p<0.001；120分钟时分别为8.15±0.27与1.30±0.11，p<0.001）和肿瘤-肝脏比（T/L）均显著高于[18F]AlF-GP2633（60分钟时分别为2.16±0.07与1.65±0.36，p<0.01；120分钟时分别为2.71±0.05与1.13±0.47，p<0.001）。

图4.Huh7原位肿瘤小鼠体内[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的动态显微PET成像。

(A)静脉注射[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P后30、60、90及120分钟的磁共振成像结果。Huh7肿瘤在原位呈现高对比度，表明[18F]AlF-NOTAIPB-GPC3P对GPC3具有选择性靶向特性。

(B)静脉注射[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P后肿瘤及主要器官的摄取时间活性曲线。在注射后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟时，Huh7肿瘤的摄取率分别为4.59±0.04%、5.22±0.37%、5.59±0.09%和5.75±0.21%（ID/g）。

(C)原位肝肿瘤肝脏大体病理观察及苏木精-伊红染色结果。

（D-F）肿瘤摄取时间活性曲线与肿瘤-器官比值（肝脏和肌肉）动态变化图谱。模型中肿瘤及主要器官对[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的摄取量及其与器官的比值，均与皮下模型中的观测结果高度一致。

图5.[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633的生物分布研究。

(A)注射后60分钟和120分钟，携带Huh7异种移植瘤的小鼠体内[ 18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的生物分布情况。(n=3)。[18F]AlF-NOTA-IPBGPC3P在Huh7肿瘤中表现出显著增强的摄取和良好的滞留效果（60分钟时为5.02±0.63%ID/g，120分钟时为5.52±0.44%ID/g），其血液循环持续时间较长且逐渐被清除。

(B)阳性对照组（Huh7）、阴性对照组（PC3）及阻断对照组在注射后60分钟的[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P生物分布情况。（n=3）。作为阴性对照模型，PC3异种移植小鼠在60分钟时的肿瘤摄取量显著低于Huh7肿瘤（1.59±0.3 % ID/g，p<0.001），这与微PET成像研究结果一致（图5B)。

(C)携带Huh7异种移植瘤的小鼠体内[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633的60分钟生物分布情况。Huh7肿瘤及60分钟时非靶向性最强器官对[18F]AlF-NOTA-IPBGPC3P的摄取量显著高于[18F]AlF-GP2633（图5C)。

(D)注射后60分钟，肝原位异种移植小鼠体内[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的肝脏分布情况。在Huh7原位移植小鼠模型中，[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P的生物分布结果与Huh7皮下移植小鼠模型中的观察结果相似。原位肿瘤的摄取量及肿瘤与器官（肝脏和肌肉）比值略高于皮下肿瘤，这与小动物PET/CT成像结果一致。这种差异可能归因于原位模型中肿瘤部位的血供更为丰富。

（E-F）[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P与[18F]AlF-GP2633的肿瘤器官比值（肌肉、肝脏和血液）。

[18F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P在非靶器官中的摄取逐渐减少。因此，该药物在Huh7肿瘤中展现出理想的肿瘤-肌肉比（15.14±0.50）和肿瘤-肝脏比（5.50±0.09），但其肿瘤-血液比相对较低（1.17±0.09）。值得注意的是，Huh7肿瘤的肿瘤-肌肉比、肿瘤-肝脏比及肿瘤-血液比均显著高于PC3肿瘤（分别为3.31±0.64、1.41±0.43和0.33±0.10）。然而，[18F]AlFGP2633的肾脏摄取量显著高于[18F]AlF-NOTA-IPBGPC3P。与[18F]AlF-GP2633相比，[18F]AlF-NOTA-IPBGPC3P在60分钟时展现出更优的肿瘤器官比（肌肉和肝脏）（T/M比：15.14±0.50 vs 10.25±1.88，p<0.01；T/L比：5.50±0.10 vs3.19±0.18，p<0.01）。

(G)Huh7和PC3肿瘤中GPC3表达的免疫组化染色结果。

[¹⁸F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P不仅在临床前研究中表现出优越的靶向能力和成像性能，还具有潜力应用于延迟成像甚至靶向放疗。未来该探针将进一步推进其临床转化，为肝癌患者提供更精准、无创的诊断新方案。

参考资料：Mo, Chunwei et al. “Synthesis and preclinical evaluation of a novel probe [¹⁸F]AlF-NOTA-IPB-GPC3P for PET imaging of GPC3 positive tumor.” Bioorganic chemistry vol. 147 (2024): 107352. doi:10.1016/j.bioorg.2024.107352