菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参生长性能、非特异性免疫及肠道微生物的影响

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国重要的水产养殖品种之一，是海水养殖业的支柱型产业。但随着自然资源的过度捕捞和市场需求的不断增长，仿刺参养殖规模在过去几十年中迅速扩大，养殖向规模化和集约化方向发展，降低了刺参免疫系统清除病原菌定植和感染的有效性，使得大量传染病暴发。应用抗生类药物控制细菌性疾病曾一度是国内外普遍使用的方法，但由此造成了耐药菌株产生、生态系统被破坏等严重后果，因而需要绿色可持续的防治手段。如今替代抗生素的产品逐渐被研发出来，包括微生态制剂、中草药添加剂、天然活性物质、免疫增强剂和益生元以及生物发酵饲料等。

固态发酵饲料作为生物发酵饲料的一种，在水产养殖中展示了良好的应用效果。研究证明发酵饲料在改善水产动物生长性能、调节消化能力、免疫水平和肠道菌群平衡等方面具有积极作用。其作用机理主要包括：①海参饲料原料经微生物固态发酵培养后仍存活着一定量的有益微生物，可以与病原菌竞争营养和附着位点，有助于清除病原菌；②经发酵后，饲料中的益生菌与底物作用产生大量活性物质，如多肽、酶类等，为机体提供营养物质，促进消化，调节免疫力。但是，发酵饲料仍存在一些亟待解决的问题。在饲料运输存放过程中，存储条件不稳定，容易产生益生菌失活现象。

为了弥补以上问题，本研究在发酵饲料中添加了菊芋全粉益生元。益生元是一类只能被益生菌分解利用，不直接被机体吸收的物质，可以促进宿主肠道内益生菌增殖，弥补发酵饲料有益微生物易失活的缺陷。菊粉是一种水溶性益生元，在调节水产动物（如鱼、虾等）肠道菌群平衡，改善其免疫系统功能，促进生长等方面具有良好效果。菊芋全粉由菊芋块茎粗加工制得，菊粉含量约60%。相较于菊粉，菊芋全粉具有成本更低、溶出率低等优势，更适合水产养殖使用。因而本研究将菊芋全粉添加到发酵饲料中制成菊芋全粉益生元发酵饲料，以探究其对仿刺参机体的影响，为益生元发酵饲料在仿刺参健康养殖中的应用提供理论基础。

1.1 试验饲料

试验所用对照（CT）组饲料为基础饲料粗粉进一步粉碎，过100目筛后与海泥按6：4比例混合得到，基础饲料粗粉与海泥均进行灭菌处理（紫外线灭菌法），基础饲料组成及营养水平如表1所示，CT组饲料主要营养成分为粗蛋白10.36%、粗纤维2.69%、粗脂肪1.06%。发酵饲料（FF）组饲料的制备步骤如下：在经灭菌处理的基础饲料粗粉中按照质量比5%的接种量加入复合菌剂（菌落总数为8.75×109 CFU/mL），复合菌剂由酵母菌（2.75×109 CFU/mL）、枯草芽孢杆菌（2.95×109 CFU/mL）、乳酸菌（3.05×109 CFU/mL）按体积比1：1：1的比例均匀混合而成，再加入40%~50%的纯化水，至饲料捏紧有水渗出松手又可散开的程度为宜。37 ℃条件下固体堆积发酵72 h，然后40~45 ℃低温烘干、粉碎、过筛，与海泥按6：4比例混合，FF组饲料主要营养成分为粗蛋白15.05%、粗纤维1.27%、粗脂肪1.12%。将菊芋全粉按15 g/kg的比例添加到对照组饲料和发酵饲料中，得到菊芋全粉益生元基础饲料和菊芋全粉益生元发酵饲料，即IBF组和IFF组饲料。FF组饲料和IFF组饲料的活菌数分别为1.75×108 CFU/g和1.80×108 CFU/g。

1.2 试验动物与养殖管理

实验室所用仿刺参由山东东营海跃水产科技有限公司养殖场提供。正式试验前，用对照组饲料暂养1周。暂养结束后选取初始体重[（30.00±0.50） g]相近的240只成参，分成4组，每组设置6组平行试验，用仿刺参循环水养殖平台进行养殖，周期60 d。养殖期间，保持水温17~20 ℃，pH 8.0~8.1，溶解氧6.5~6.7 mg/L，盐度27‰~29‰，氨氮含量<1.0 mg/L，亚硝酸盐氮含量<0.1 mg/L。每天16：00清理粪便后投喂饵料，投喂量为刺参体重的3%，每7 d换全部海水。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

在正式养殖试验开始和结束时分别称量记录刺参的初始体重（W0）和最终体重（Wt），养殖过程中记录进食量，并用以下公式计算刺参的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料系数（FC）。

WGR（%）=（Wt-W0）/W0×100 

SGR（%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100 

FC=F/（Wt-W0） 

式中：t——养殖试验时间（60 d）；

F——总摄食量（g）。

1.3.2 免疫指标测定

培养第60天，每个水箱随机抽取3只刺参，从腹部收集体腔液，加入等量抗凝剂（0.02 mol/L EGTA、0.48 mol/L NaCl、0.019 mol/L KCl、0.068 mol/L Tris-HCl，pH为7.6）。将3个抗凝体腔液样本混合成一个样本混合物，经液氮速冻后放入-80 ℃冰箱保存待测。体腔细胞总数用血球计数板计数。

吞噬活性测定：将100 μL的体腔液放入96孔板中，25 ℃贴壁30 min，去掉悬液，然后加入100 μL 0.001 mol/L中性红溶液，在25 ℃下孵育30 min。用pH 7.6的PBS洗掉未被吞噬的中性红，加入100 μL的细胞裂解液（乙醇：冰醋酸=1：1），裂解20 min，用酶标仪测定540 nm波长处的吸光度OD值，在此试验条件下每107个体腔细胞对应的OD值表示吞噬活性。

酚氧化酶（PO）活性测定：首先制备体腔细胞破碎物上清液（CLS），将体腔液在4 ℃离心10 min（3 000 r/min），收集体腔细胞，弃去上清液，用PBS重悬细胞（pH 7.6），超声细胞破碎仪冰水浴超声（每次5 s，间隔10 s，共3次），后继续4 ℃离心10 min（5 000 r/min）。取50 μL制备的CLS样品和50 μL 0.1 mg/mL胰蛋白酶放入96孔板中，充分混匀，室温下孵育10 min，加入50 μL 3 mg/mL左旋多巴，室温下孵育5、10 min，测定492 nm波长处的吸光度OD值。

刺参体腔液样品中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性采用试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）测定。

1.3.3 肠道菌群结构分析

养殖试验结束，从每个水箱中随机取3只刺参用70%乙醇溶液消毒表面后解剖，取出肠道及内容物，剥离呼吸树，无菌生理盐水冲洗3次后转移到无菌离心管中，经液氮速冻后放入-80 ℃冰箱保存待测。用DNA提取试剂盒提取刺参肠道总DNA，通过PCR扩增原核核糖体RNA基因（16S rDNA）的V3~V4区，引物为338F和806R。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测，最后构建文库、上机测序。

1.4 数据处理与分析

数据均以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 21.0软件进行相关性检验、单因素方差分析（one-way ANOVA)，用Duncan’s多重比较法分析组间平均值的差异显著性，以P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05为差异不显著。

2.1 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参生长性能的影响（见图1~图3）

由图1和图2可知，与对照组（CT）相比，所有试验组都显著提高了刺参的增重率和特定生长率（P<0.05）。其中，菊芋全粉益生元发酵饲料组的提高效果最明显，但与菊芋全粉益生元基础饲料组差异无统计学意义，发酵饲料组对增重率和特定生长率也有一定的提高效果。

由图3可知，试验组均显著降低了饲料系数（P<0.05）。说明对饲料进行发酵处理以及在基础饲料和发酵饲料中添加菊芋全粉都能提高饲料的利用率，但各试验组之间差异无统计学意义。

2.2 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参非特异性免疫的影响

2.2.1 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参体腔细胞数目（TCC）的影响（见图4）

60 d的养殖周期结束后对刺参各项免疫指标进行测定。由图4可知，与对照组（1.63×106个细胞/mL）相比，菊芋全粉益生元基础饲料组（1.14×107个细胞/mL）和菊芋全粉益生元发酵饲料组（1.40×107个细胞/mL）体腔细胞数均明显增加（P<0.05），发酵饲料组（2.47×106个细胞/mL）增加效果不显著（P>0.05）。

2.2.2 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参吞噬活性的影响（见图5）

如图5所示，与体腔细胞数量情况类似，相比于对照组，菊芋全粉益生元基础饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组对刺参体腔细胞吞噬活性的提升有显著效果（P<0.05），且菊芋全粉益生元发酵饲料组的吞噬活性最高。

2.2.3 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参酚氧化酶（PO）活性的影响（见图6）

从图6可以看出，各试验组刺参PO活性较对照组均有所提高，但发酵饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组效果更显著（P<0.05），菊芋全粉益生元发酵饲料组活性最高，菊芋全粉益生元基础饲料组与对照组相比没有统计学差异（P>0.05）。

2.2.4 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响（见图7）

由图7可知，菊芋全粉益生元基础饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组对提高刺参SOD活性有一定作用，但效果不显著（P>0.05），发酵饲料组没有提高。说明菊芋全粉和发酵饲料对SOD活性的影响较小。

2.2.5 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参总一氧化氮合酶（T-NOS）活性的影响（见图8）

如图8所示，菊芋全粉益生元基础饲料组T-NOS活性有所提高，但发酵饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组T-NOS活性都呈现下降状态，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2.6 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性的影响（见图9~图10）

由图9和图10可知，各试验组ACP活性和AKP活性都所提高，其中菊芋全粉益生元发酵饲料组效果最为显著（P<0.05）。其他试验组与对照组相比无显著差异（P>0.05）。

2.3 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参肠道微生物的影响

2.3.1 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参肠道微生物α多样性的影响

60 d的养殖试验周期结束后，通过Illumina MiSeq平台进行测序，所得高质量序列聚类形成1 034个独特操作分类学单元（OTUs，序列标识97%）。α多样性（alpha diversity）是指分析单个样品中的物种多样性，包含两个主要因素：丰富度（richness）和均一性（evenness）。

由图11~图13可知，与对照组相比，各试验组丰富度和多样性均明显提高，其中菊芋全粉益生元基础饲料组的丰富度和多样性最高。在均一性上，发酵饲料组略有降低，菊芋全粉益生元基础饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组明显降低。说明发酵饲料和在饲料中添加菊芋全粉能显著改变刺参肠道微生物α多样性（P<0.05）。

2.3.2 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参肠道微生物β多样性的影响

Beta多样性分析通过各样本序列间的进化关系及丰度信息计算样本间距离，评价样本间微生物群落是否具有显著差异。图14是基于Bray-Curtis 距离算法的PCoA二维图，发酵饲料组和菊芋全粉益生元基础饲料组菌群分散程度较接近，且均与对照组有明显差异，菊芋全粉益生元发酵饲料组与对照组菌群分散程度相近。

2.3.3 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参肠道微生物种类的影响

由1个对照组和3个试验组全部OTU（基于97%相似性水平划分）制作的Venn图如图16所示，有效OTU总数为1 034个，4个处理组共有的OTU数为253个。发酵饲料组和菊芋全粉益生元基础饲料组特有的OTU数较多，分别有216个和200个，菊芋全粉益生元发酵饲料组特有OTU数量相对少一些。但从各试验组与对照组共有OTU数占各组比例来看，菊芋全粉益生元基础饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组较少。

3.1 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参生长性能的影响

菊芋全粉富含水溶性益生元的菊粉，具有调节肠道微生物群落结构、促进肠胃功能、增强免疫力等作用。益生元的作用机制可能是：通过改善肠道内环境，促进益生菌增殖，降低有害菌比例，促进对营养物质的吸收利用从而利于动物的生长；改善肠道结构，增加肠绒毛长度和肠道隐窝深度。进而促进营养物质的吸收。有研究表明，仿刺参的生长状况与其肠道微生物有密切关系。菊芋全粉中含有约60%的菊粉，微溶于水且成本更低，在水产养殖中的应用愈加广泛。发酵饲料从本质上来看，融合了饲料、微生态制剂及酶制剂，将其应用在水产养殖中发挥的是多种产品的综合作用。初始饲料经发酵菌种作用，部分大分子蛋白降解成刺参能直接消化吸收的小分子肽、氨基酸等，提高蛋白质利用率，发酵饲料产生的生物活性因子还能提高饲料适口性。在研究中，将菊芋全粉添加到发酵饲料中，以探究菊芋全粉益生元与发酵饲料的协同作用。由结果可知菊芋全粉益生元发酵饲料显著提高了仿刺参的增重率、特定生长率，且降低了饲料系数，对生长性能的提高有显著效果。这与贾晨晨（2019）和孟现尧（2020）的研究一致，他们发现，在饲料中添加适量的菊芋全粉能显著提高仿刺参和凡纳滨对虾的生长性能，仿刺参的成活率和生长速度得到明显改善，凡纳滨对虾的特定生长率和增重率都有提升。除菊芋全粉外，还有很多功能性低聚糖是典型的益生元，如低聚木糖、褐藻寡糖等。李君华等（2016）研究发现饲料中添加0.030%~0.075%的低聚木糖（XOS）显著提高仿刺参幼参的生长性能，最适添加量为0.044%。Xu等（2017）将益生元菊芋全粉和褐藻寡糖按3：1的比例加入协同添加剂，用于刺参养殖，提高了刺参的生长性能和非特异性免疫反应，促进其健康生长。另外，本研究结果也与孙兴（2015）在研究固态饲料对刺参的影响时的结果一致，试验发现发酵饲料将刺参增重率提高了18.30%，显著减小脏壁比，对刺参生长有良好的促进作用。王世英（2015）研究发现，发酵海带能通过提高产物粗蛋白含量促进刺参生长，提高消化酶活性，并且优于直接在饲料中添加益生菌。另外还有研究结果显示生物发酵饲料提高了罗氏沼虾的增重率，降低了鲤鱼幼鱼的饲料系数。但也有研究发现，高水平发酵豆粕使得凡纳滨对虾生长性能下降，可能是发酵豆粕中的抗原蛋白造成的，说明发酵饲料在水产养殖中的应用还需要更多的条件优化。

3.2 菊芋全粉益生元发酵饲料对仿刺参免疫力的影响

仿刺参是一种棘皮动物，缺乏特异性免疫反应，除皮肤和黏膜外，非特异性免疫反应是保护刺参免受病原菌感染的第一道防线，分为细胞免疫和体液免疫。相关指标包括体腔细胞总数、吞噬活性及免疫酶（PO、SOD、NOS、ACP和AKP）活性等。现有研究表明，益生元能够增强仿刺参非特异性免疫系统，一些功能性低聚糖益生元具有免疫调节功能，能与病原菌细胞表面或毒素等外源性抗原结合，减缓抗原吸收，增加抗原效价；还能通过促进益生菌增殖提高水产动物体内抗体水平，激活巨噬细胞吞噬活性。

体腔细胞吞噬是棘皮动物主要的非特异性防御机制，所以体腔细胞数量及吞噬活性能在一定程度上反映机体的免疫力。本试验中菊芋全粉益生元发酵饲料组的刺参体腔细胞数和吞噬活性都有明显提高，吞噬活性的提高可能与体腔细胞中与吞噬作用相关的两类细胞：变形细胞和颗粒细胞数量的增加有关，也可能与体腔液中相关免疫因子凝集素、调理素有所联系。PO在机体体内出现病原体或组织受损时能精密地调控异物包裹过程中的黑化过程，从而起到防御效果，因而在棘皮动物非特异性免疫中具有重要作用。已有研究发现，细菌细胞壁所含胰蛋白酶、脂多糖、肽聚糖等成分可诱导激活PO活性。发酵饲料组和菊芋全粉益生元发酵饲料组PO活性显著增强，说明发酵饲料中丰富的益生菌及其代谢产物可能激活了酚氧化酶原系统，使PO活性提高。这一结果，与前人的研究相近。贾晨晨（2019）发现饲料中添加菊芋全粉可明显提高仿刺参PO活性，增强吞噬细胞吞噬活性，提高体腔细胞数量，但不同免疫指标对菊芋全粉敏感度不同。司滨（2017）发现壳寡糖对仿刺参体腔细胞吞噬活性和呼吸爆发有显著提高，这可能是由于壳寡糖与体腔细胞表面受体结合，促进了刺参的免疫反应。SOD是一种抗氧化酶，已被证实在棘皮动物体内存在，SOD既能直接参与抑制病原菌的过程又能及时清除在吞噬细胞呼吸爆发时产生的活性氧自由基，进而避免机体受到损伤。关于水产动物组织中SOD活性受有关物质影响的试验，所得结论有较大差异。本试验中各试验组对SOD活性的影响不显著，这是由于SOD活性过高会减少呼吸爆发产生的超氧阴离子，降低防御能力，过低又无法发挥防止自身氧化受损害的作用，应当保持在一个正常范围。而菊芋全粉益生元和发酵饲料产物可能是直接参与抑制自由基，维持了刺参体内SOD活性的稳定。NOS是非特异性免疫的重要组成部分，病原菌、免疫刺激物等能诱导iNOS产生大量一氧化氮（NO），再通过反应产生不同类型活性氮中间体，杀灭病原生物。菊芋全粉益生元基础饲料组NOS活性增强，证实菊芋全粉对提高NOS活性有一定作用，但发酵饲料会降低其活性，说明发酵饲料对机体的部分免疫因子增强效果受饲养动物种类、饲料原料种类、营养水平、养殖环境等多因素影响。这一结果与赵丽丽等（2019）和Wang等（2014）的研究结果一致。ACP作为吞噬溶酶体的标志酶之一，在体腔细胞进行吞噬、包囊反应时常伴随着ACP的释放，因此可以通过ACP活性高低判断巨噬细胞的激活程度，从而评价机体免疫水平。AKP也是溶酶体的标志酶之一，可以改变病原菌的表面结构以提高其异己性，起到调理素的作用，可以作为判断机体免疫力的重要指标。本研究中菊芋全粉益生元发酵饲料组ACP和AKP活性与对照组相比均有明显提高。这与前人研究结果相近。李君华等（2016）在试验中发现低聚木糖提高了仿刺参幼参相关免疫因子的合成，从而提高体腔液中SOD、AKP等免疫酶活性。陈萱等（2015）在异育银鲫养殖试验中发现，用发酵豆粕代替鱼粉显著提高其AKP活性。

3.3 仿刺参肠道微生物多样性及组间差异分析

肠道微生物群会通过发育、营养消化、免疫和抗病等多种途径影响宿主，已有研究表明肠道微生物在仿刺参生长的各个阶段都发挥着重要的生理作用和防御作用。就丰度而言，主要是细菌在发挥作用，因而对仿刺参肠道菌群的研究分析具有重要意义。Song等（2014）发现益生元可以通过直接刺激或优化共生菌群的组成来激活鱼的先天免疫系统。但目前关于仿刺参肠道微生物的研究较少，我们为了探究菊芋全粉益生元和发酵饲料对刺参肠道微生物区系的影响，对其进行了16S rDNA测序。Alpha多样性分析结果显示，菊芋全粉益生元发酵饲料显著提高了刺参肠道微生物的丰富度和多样性，降低了均一性，说明其改变了刺参的肠道微生物区系结构。这与Dimitroglou等（2010）在金头鲷饲料中添加甘露寡糖的养殖试验结果相似。司滨（2017）也发现壳寡糖能够增加仿刺参肠壁菌群多样性和菌落丰度，但潘金露（2016）发现壳寡糖降低了大菱鲆肠壁菌群的丰富度，说明益生元对水产动物肠道菌群多样性的作用还受其他因素影响。Beta多样性方面，发酵饲料和菊芋全粉益生元基础饲料组与对照组菌落分散差异显著，但菊芋全粉益生元发酵饲料没有对刺参肠道菌落聚集情况产生较大影响，同源性更强，说明菊芋全粉益生元发酵饲料不会导致刺参肠道菌群结构的异常化，佐证了其绿色安全性。Yang等（2015）发现膳食补充β-葡聚糖显著改变了刺参肠道微生物的Beta多样性，但总体来说益生元和发酵饲料对水产动物的Beta多样性影响的研究比较少见。通过对仿刺参肠道微生物种类进行比较分析发现，在门水平上，菊芋全粉益生元和发酵饲料能显著改变优势菌群中变形菌门和厚壁菌门丰度。变形菌门是丰度最高的一门，含有多种病原菌，试验组降低了变形菌门丰度，说明菊芋全粉益生元和发酵饲料能够抑制病原菌增殖。厚壁菌门能促进多糖发酵，试验组厚壁菌门丰度的增加说明其还可以促进益生菌增殖。在目水平上，红杆菌、葡萄球菌和芽孢杆菌各处理组间存在显著差异。前人研究发现红杆菌是一种水生光合细菌，是一种潜在的益生菌，可能与刺参的生长性能有关，在体型较大的刺参肠道内红杆菌数量较多。这一结论与本研究结果有所出入，说明影响仿刺参生长性能的因素较为复杂，还可能与肠道形态、消化酶活性等因素有关。各试验组均提高了芽孢杆菌的丰度，芽孢杆菌对病原菌具有拮抗作用，具有良好的脱氮去磷活性，还能提高外源性消化酶活性。由此可见，菊芋全粉益生元和发酵饲料确实起到抑制病原菌增殖、提高益生菌丰度的作用。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2022，43（10）：57-64

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