植物多酚的生物活性及在反刍动物生产中的应用

自2006年欧盟禁止使用饲用抗生素以来，人们一直在不断地寻找能够维持以及改善动物健康状态和生产性能的饲料添加剂，其中，植物源天然化合物被认为是饲用抗生素的良好替代品之一。植物多酚（plant polyphenol，PP）作为植物次级代谢产物的一种，存在于水果、蔬菜、谷物、茶、咖啡等多种植物中，其基本结构为不含氮的带有一个或多个羟基基团的酚环结构，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌等。文章在阐明PP结构和分类的基础上，综述其生物活性及作用机制，总结其在反刍动物生产中应用情况，以期为今后PP的广泛应用提供理论依据。

PP是植物中的第四大主要成分，其含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。最初人们按照PP的化学结构特征将其分为水解单宁（hydrolysable tannins，HT）和缩合单宁（condensed tannins，CT）两个类型。随着研究的深入，Haslam等（1990）在不考虑分子量的基础上，根据单宁的分子结构，将PP分为聚棓酸脂类（含HT及相关化合物）和聚黄烷醇类（含CT及相关化合物）。直到2011年，Quideau等（2011）重新提出了PP的定义：指由莽草酸衍生的苯丙烷和/或聚酮途径合成的植物次级代谢产物，其结构中具有多个酚环，且在基本结构中不含氮的一类酚类化合物。因此，目前根据酚环的数量及其相互结合的结构元素，分为类黄酮型和非类黄酮型两大类。PP的分类、结构、来源及生物活性见表1，典型PP化学结构见图1。

类黄酮型种类达到4 000多种，其结构中共有两个苯环，由三个碳原子形成的含氧杂环相连，通常为C6-C3-C6结构。根据杂环的类型，可分为以下亚类：黄酮醇、黄酮、黄烷-3-醇、黄烷酮、花青素和异黄酮。常见类黄酮型包括槲皮素、儿茶素、花青素、大豆苷元等。非类黄酮型主要为酚酸、芪类两类。酚酸于谷物中多见，根据碳骨架分为两类，分别是C6-C3型（如阿魏酸、咖啡酸、香豆酸和芥子酸等肉桂酸）和C6-C1型（如没食子酸、香草酸等苯甲酸）。芪类为二苯乙烯类化合物，白藜芦醇最为典型，其结构为由一个双碳亚甲基桥连接的两个酚环。PP在化合物中的含量如表2所示。

2.1 抗氧化活性 

抗氧化活性是PP研究最为深入的特性。体外研究证实，PP对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基具有很强的清除活性。目前研究发现，PP中抗氧化活性最高的物质是杨梅酮。Barzegar（2016）以二氯二氢荧光素（DCF）探针作为MCF-7细胞内活性氧（ROS）的指示剂，发现2 μg和5 μg的杨梅酮均可直接抑制细胞内ROS的产生。这与PP的结构密切相关，如图2所示：①B环上的邻苯二酚基团具有显著的清除ROS或活性氮（RNS）的能力；②B环上的羟基是自由基的电子和氮的供体；③C环可以使苯氧自由基更具稳定性，增强抗氧化活性；④当A环和C环上存在4-OH时，7-OH具有最大的自由基清除能力；⑤A环的5-OH和7-OH基团可以与金属离子络合，增加自由基清除能力。目前PP螯合金属离子，抑制氧化应激产生的能力已得到证实。Bong-Jeun（2004）研究发现，绿茶多酚可以螯合金属离子（Cu2+、Fe2+），加速阻止O2-和H2O2变成羟自由基（·OH）。当其浓度在5 mg/kg以上时，Cu2+的螯合效果可达80%以上，而在50 mg/kg以上时，Fe2+的螯合效果可达70%左右。不仅如此，近年来国内外学者通过对PP抗氧化机制的深入研究，发现PP还可以通过核因子E2相关因子2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf2）-抗氧化反应原件（antioxidant responsive element，ARE）信号通路诱导抗氧化酶或Ⅱ相解毒酶表达上调。买地娜依等（2018）研究发现，1、10、50 μg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）均可以上调3T3-L1脂肪细胞Nrf2和HO-1的基因表达量，进而提高细胞内谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低丙二醛（MDA）含量，抑制细胞发生氧化应激，且呈剂量依赖性。进一步研究表明，EGCG可激活丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK），触发Nrf2磷酸化，或直接与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）中的半胱氨酸残基互作，从而诱导Nrf2解离。此外，Gan等（2016）证实25 μmol/L白藜芦醇可通过ERK5/HDAC5途径激活Mn-SOD的表达，从而减轻内皮细胞线粒体氧化应激。Liu等（2018）发现，蓝靛果多酚（0.05%和0.1%）可有效促进高脂饲粮诱导的小鼠肝脏内Nrf2、HO-1和MnSOD等抗氧化蛋白的表达，从而降低脂质过氧化水平。综上所述，PP参与调控抗氧化作用的调节机制主要包括：①清除自由基；②螯合金属离子抑制活性氧的形成；③激活Nrf2-ARE、ERK5/HDAC5等信号通路，诱导抗氧化酶或Ⅱ相解毒酶表达。

2.2 抗炎活性

体内、外试验均已证明PP可通过抑制促炎细胞因子的表达实现其抗炎活性。蓝莓花色苷、黑莓花色苷和黑醋栗花色苷（20 μg/mL）能显著降低脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNFα） mRNA的表达水平及含量。绿茶多酚（1 mg/mL）则可以抑制Caco-2细胞（人结直肠腺癌细胞）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的释放，降低细胞通透性，预防炎症性肠道疾病。在炎症过程中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶2（cyclooxygenase，COX-2）及各自催化产物一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），参与并加重炎症。Koeberle（2009）发现姜黄素（30 μmol/L）可以通过抑制COX-2的表达和直接激活mPGE2活性来抑制PGE2的产生。蔡美云等（2020）进一步发现，80 μmol/L的山奈酚（KAE）可通过抑制P38 MAPK/NF-κB信号通路，显著降低iNOS和COX-2的表达，进而减轻神经毒素6-羟多巴胺诱导的PC12细胞炎症反应的发生。NF-κB原本与I-κBα抑制剂结合存在于胞浆中，但当细胞受到炎症因子刺激时，I-κBα被磷酸化和降解，从而释放NF-κB进入细胞核，诱导促炎基因表达。研究发现，PP可以抑制NF-κB核转位，如从黑豆中分离出的花青素就可以有效抑制NF-κB转位到细胞核中。故PP发挥抗炎活性的途径有：①抑制促炎细胞因子的表达；②抑制MAPKs及NF-κB信号通路介导iNOS和COX-2的表达，进而抑制炎症；③抑制NF-κB核转位。

2.3 抗菌活性

多酚是植物抵抗虫害、病害而产生的次级代谢产物，本身就具有广谱的抗菌活性。研究发现，PP可以抑制细菌胞内DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的合成。Katarzyna（2006）在哈维氏弧菌中加入染料木黄酮（0.1 mmoL/L），15 min后菌体DNA和RNA合成就受到了强烈抑制。PP抑制生物大分子合成的作用，可能与其降低细胞膜流动性、提高细胞膜通透性的特性有关。在Rosangela等（2010）的研究中发现，经过百里香酚、丁香酚和香芹酚处理后，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株内，饱和C16脂肪酸和饱和C18脂肪酸含量增加，不饱和C18脂肪酸含量相应减少，表明PP可通过减少不饱和脂肪酸含量降低细胞膜流动性。另外，PP提高了菌体细胞膜通透性，可造成细胞内ATP外泄，达到抑菌效果。近年来还有研究证实，PP对葡萄糖运输或利用的抑制作用及对细胞膜渗透性的影响是导致细菌ATP的合成被抑制的重要原因。如百里香酚可通过参与三羧酸循环来降低沙门氏菌胞内ATP的合成。不仅如此，随着研究的深入人们发现，PP可通过堵塞外膜孔蛋白阻碍葡萄糖等亲水小分子进入胞内而发挥抗菌作用。Motokazu等（2013）通过透射电镜分析发现，EGCG会沉积在大肠杆菌细胞表面最外层的膜上，与细菌外膜蛋白G（OmpG）的通道相互作用，进入孔道并通过氢键与孔道内表面的精氨酸（Arg）残基结合，从而抑制葡萄糖等亲水小分子的被动转运，进而达到抑制大肠杆菌生长的目的。综上所述，PP发挥抑菌作用的机理主要包括：①抑制胞内DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的合成；②改变细胞膜中脂肪酸的组成，降低细胞膜流动性，提高细胞膜的通透性；③抑制ATP的合成，影响细菌的能量代谢；④堵塞外膜孔蛋白，阻碍葡萄糖等亲水小分子进入胞内。

3.1 对反刍动物生长性能的影响

在反刍动物饲养过程中，饲料的成本一直以来均是影响养殖经济效益的主要因素之一，如何在减少饲料成本的基础上仍然能够提高反刍动物采食量及日增重是畜禽生产中有待解决的问题。研究发现，PP可以提高反刍动物的生长性能。一方面是由于PP作为天然的抗氧化剂能够降低反刍动物在饲养过程中受到的应激；另一方面是由于PP可以降低蛋白质在瘤胃内的降解率，进而促进机体对蛋白质的吸收。薛树媛（2011）研究发现，在日粮中添加1%和2%的五倍子单宁酸可以提高绵羊的增重，降低料重比，但当添加量达到3.5%时，绵羊的平均日增重（ADG）却降低。同样，杨文军等（2020）研究发现，与对照组相比，10 mg/kg和20 mg/kg葡萄籽原花青素（含有96.40%原花青素、0.53%儿茶素、0.24%表儿茶素、0.23%儿茶素没食子酸酯和0.17%表儿茶素没食子酸酯）可以显著提高羔羊的ADG和平均日采食量（ADFI），但是40 mg/kg葡萄籽原花青素却降低了羔羊的ADFI。这是因为，高浓度的PP会影响瘤胃内菌群的数量及组成，尤其是抑制瘤胃内纤维分解菌的生长，使饲料转化率降低，生长受到抑制。杨春涛（2016）研究发现，PP还可以增强犊牛瘤胃内消化酶活性、降低腹泻率，以此提高饲料转化率和ADG。此外，白藜芦醇是有效的植物雌激素，可以通过下丘脑-垂体激素轴影响生长激素（GH）、表皮生长因子（EGF）和类胰岛素样生长因子1（IGF-1）的分泌，促进犊牛肌肉组织的生长，最终加快生长速度。

综上所述，尽管大部分的PP均可以改善反刍动物的生长性能，但是不同PP的提取方法、添加水平等因素对反刍动物生长性能的影响均不一致。且研究发现PP添加剂量过大还会给反刍动物生长带来一定的负面影响，推测其原因可能是PP的添加水平存在一定的差异性，当添加水平不适时会导致反刍动物瘤胃内环境稳态以及机体免疫功能受到影响，进而表现出生长性能降低或无任何影响。因此在实际应用中应注意PP种类、提取方法和添加水平等的选择，以此达到增加养殖者经济效益的目的。

3.2 对反刍动物瘤胃发酵的影响

研究发现，PP可以改善瘤胃发酵，提高蛋白质代谢率、降低甲烷产生、减少瘤胃胀气，进而改善动物的健康状况和生产性能。同时，PP被认为是一种天然的过瘤胃蛋白保护剂，在瘤胃pH 5~7时，PP中的酚羟基和苯基可与蛋白质的氨基与羧基结合，形成难以被瘤胃降解的多酚-蛋白质复合物，减少瘤胃中饲料蛋白质的降解，提高瘤胃内微生物蛋白的合成量。研究表明，大豆异黄酮可以提高山羊瘤胃内菌体蛋白浓度及挥发性脂肪酸的含量，促进瘤胃微生物的氮代谢。同样，苜蓿黄酮可以稳定瘤胃内环境，促进瘤胃对氮的吸收，有效改善瘤胃发酵功能。牟春堂（2020）发现，葡多酚可以调控绵羊瘤胃发酵，提高pH，降低丁酸比例，且200 mg/kg添加量效果最佳。此外，PP还可以通过抑制瘤胃内产甲烷菌从而降低甲烷排放量。Oskoueian（2013）研究发现，在干物质基础上添加4.5%的柚皮苷和槲皮素，可以抑制甲烷的产生，降低瘤胃内原生动物和甲烷菌的数量，且不影响干物质降解率及其他发酵参数。由此可见，适宜的PP可以有效改善瘤胃发酵过程，促进氮代谢，提高微生物蛋白合成量及挥发性脂肪酸的浓度，同时降低瘤胃内有害菌的数量，减少养殖过程中甲烷的排放。原虫代谢过程中所产生的氢是甲烷菌合成甲烷的原料，PP之所以能够有效减少甲烷的产生，其原因主要是PP提高了厌氧真菌的数量，进而降低了原虫和甲烷菌的数量。但截至目前，有关PP对原虫数量的抑制机制尚不明确，可能是PP改变了细胞膜的流动性和通透性，造成细胞溶解死亡，以此降低了原虫数量。

3.3 对反刍动物抗氧化能力的影响

随着现代畜牧业集约化程度不断提高，氧化应激在畜禽生产中的危害已大量显现，不仅给养殖业造成重大损失，还因氧化产物的积累导致畜禽产品品质降低，进而影响食品的卫生质量，危及人类健康和环境安全。PP是天然的外源性抗氧化剂，可以有效调节反刍动物机体抗氧化酶活性。孙玉丽等（2012）选取40头中国荷斯坦奶牛，试验组灌服20 g/d的杜仲素，发现其显著降低奶牛血液中MDA的水平，SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的活性则有一定的上升趋势。与之相似，Wang等（2018）选取28 d荷斯坦断奶前公犊利用大肠杆菌O141：K99进行攻毒试验，试验组饲喂3 g/d桑叶黄酮，结果发现，与对照组相比，饲喂桑叶黄酮后犊牛血液中SOD、GSH-Px升高，MDA水平降低。不仅如此，Basiricò等（2019）研究发现，EGCG可以通过提高奶牛乳腺上皮细胞中GSH和γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）活性，进而降低MDA水平。葡萄籽原花青素则可以改善羔羊氧化应激状态，减轻高精料日粮诱导的羔羊氧化应激。众所周知，过多的ROS积累不仅会导致氧化应激，还可以激活NF-κB，诱导促炎细胞因子的表达，这表明氧化应激可以触发炎症反应。在Colitti（2006）的一项早期研究中，在围产期每天给母牛饲喂10 g的葡萄多酚，观察到Nrf2靶基因SOD的mRNA浓度在产犊后增加，且ROS的生成受到了抑制。这说明葡萄多酚可能诱导胎后细胞保护机制，以应对氧化应激和炎症应激。

PP作为植物源的天然抗氧化剂具有高效、安全、无副作用的特点，加之其在生物体内具有清除自由基、防止氧化损伤等作用，故可作为化学合成抗氧化剂的新型替代品。将PP应用于饲料添加剂中，既可以改善动物免疫力及抗氧化损伤能力，还可提高动物的生产性能和品质，可见PP是很具有发展前景的天然抗氧化剂之一。

3.4 对反刍动物免疫功能的影响

良好的免疫系统可以抵抗病原入侵、预防疾病发生、清除体内衰老损伤及死亡的细胞，在动物的健康生长方面发挥着重要的作用。PP可以增加机体免疫细胞数目，提高免疫细胞活性及分泌能力，进而提高反刍动物的免疫功能。免疫细胞是机体免疫系统的重要组成部分之一，包括T细胞和B细胞。其中T细胞介导的细胞免疫由CD8+抑制杀伤亚群和CD4+辅助亚群组成。CD4+细胞根据分泌因子的不同又分为Th1和Th2两个亚群。Th1细胞主要分泌白介素-2（IL-2）、干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）等Th1型细胞因子，介导细胞免疫、抑制B细胞等；Th2细胞分泌白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、IL-6、白介素-10（IL-10）等Th2型细胞因子，可促进B细胞激活及分化并产生抗体，介导体液免疫反应。研究发现，在绵羊日粮中添加PP后，其会在绵羊的肠道内发挥作用，促进B淋巴细胞的增殖，增加免疫球蛋白的分泌，最终增加绵羊外周血中CD4+淋巴细胞的数量，提高绵羊的免疫性能。在Oliveira等（2010）的一项试验中，研究了石榴多酚对荷斯坦奶牛免疫功能的影响，犊牛饲喂5 g/d或10 g/d的石榴多酚，显著增加其外周血IFN-γ、IL-4以及免疫球蛋白G（IgG）含量。与之相似，郭竟升（2018）研究发现，精料中添加牛至精油可显著提高犊牛血液免疫球蛋白浓度，增强犊牛免疫功能。此外，解湧芳（2020）研究发现PP可通过抑制NF-κB通路激活，下调绵羊外周血淋巴细胞IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达量，提高机体的免疫功能。大量研究已证实，PP可以通过不同的途径提高机体的免疫功能，但PP本身结构较为复杂，因此目前对PP功能系统的认知并不全面。机体的免疫系统和抗氧化系统是相互联系且相互影响的，当机体发生免疫应激时，随之也会引起抗氧化系统的失衡，进而发生氧化应激反应，可见PP具有联动发挥抗炎/抗氧化活性保护机体的活性。

PP具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，有来源广泛、无副作用、摄入后易被肠道消化吸收等特点，是一种应用前景十分广阔的饲料添加剂。然而，PP的来源和结构、添加剂量、动物品种、饲养环境以及饲喂周期均可能影响反刍动物对其调控作用的响应，因此希望通过不断的探索和完善，PP能早日大规模投入生产，实现其在反刍动物生产中的广泛应用。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2022，43（1）：18-23

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