冰鲜黑水虻对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、生化及肠道菌群的影响

黑水虻（Hermetia illucens L.）隶属双翅目水虻科，分布在美洲热带、亚热带和温带地区[2]。在自然状态下，黑水虻昆虫是部分肉食性和杂食性鱼类的天然饵料[3]。有研究表明，黑水虻可作为鹦鹉鱼[4]、鲈鱼[5]、凡纳滨对虾幼虾[3]、斑马鱼[6]、小丑鱼[7]饲料的蛋白质或脂肪源。还可以利用黑水虻规模化处置和转化有机废弃物，也可以作为优质的饲料原料用于水产动物饲料生产[8]。有研究结果表明，黑水虻部分代替商业饲料中的豆油可增强草鱼抗氧化能力，提高肠道菌群的丰度和多样性[9]，替代40％鱼粉蛋白对大黄鱼幼鱼的生长性能、体成分及健康状况无负面影响[10]，在豆粕用量为35%的罗非鱼饲料中，使用黑水虻虫沙（花生麸转化）替代45%豆粕对罗非鱼生长性能没有显著影响[11]。说明黑水虻具有良好的效果，同时可以适当地减少成本，具有良好的应用前景。

本试验使用冰鲜黑水虻投喂珍珠龙胆石斑鱼，旨在研究其对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、消化酶、肝脏生化指标及肠道菌群等方面的影响，为冰鲜黑水虻在养殖过程中的实际应用提供理论依据。

1.1 试验动物

试验鱼购于天津立达海水资源有限公司，随机挑选规格一致、体质健康的珍珠龙胆石斑鱼，平均体重（8.1±0.2） g，体长（5.0±0.5） cm。冰鲜黑水虻由天津农学院农业废弃物资源化利用团队提供。黑水虻幼虫粗蛋白含量为40.36%，粗脂肪含量为21.12%。

1.2 试验设计

试验鱼暂养7 d后，选出健康、规格基本一致的450尾石斑鱼，随机分为3组，每组3个重复，每个重复50尾。将饲料与研磨后的黑水虻直接投喂，各组饲料中冰鲜黑水虻占的比例为0(E组）、50%（H组）、100%（xC组），试验期28 d。饲料投喂量为鱼体重的3%~5%，每天进行2次投喂（08：00、16：00）。每次早上投喂1 h后换水1/3~1/2。试验期间水温为（25±1） ℃，溶解氧7.5~8.0 mg/L，盐度为31‰。基础饵料购于某有限公司，试验饵料组成：粗蛋白≥48.0%、粗脂肪≥10.0%、粗纤维≤2.0%、粗灰分≤16.0%、赖氨酸≥2.5%、水分≤10.0%、总磷1.5%~3.0%。

1.3 样品采集

各组鱼饥饿24 h后进行采样，每组选取25尾石斑鱼，对体重、内脏、肝脏称重，取前肠、中肠、后肠。低温下进行解剖收集石斑鱼肝脏，-80 ℃冰箱保存，备用。使用生理盐水按照1：9制备肝脏组织匀浆液，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，取上清液进行相关指标测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长指标

脏体比（VSI，%）=100×内脏重/体重

肝体比（HSI，%）=100×肝脏重/体重

增重率（WGR，%）=100×（终末均重-初始均重）/初始均重

特定生长率（SGR，%/d）=100×（ln终末均重-ln初始均重）/饲养天数

存活率（SR，%）=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数

饵料系数（FCR）=总投饵量/鱼总增重量

1.4.2 消化酶活性

淀粉酶和脂肪酶活性均使用购自南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒测定，蛋白酶活性采用福林酚法测定。

1.4.3 抗氧化与非特异性指标

肝脏蛋白质的酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性及丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）采用比色法测定，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4.4 肠道菌群的测定

停食1 d采集样本，麻醉鱼后，用75%乙醇擦拭体表，用无菌解剖剪剪开腹部，在无菌状态下取出整个肠道，用吸水纸擦干表面血污，用无菌生理盐水冲洗肠道外壁数遍。将肠道样品送至上海某生物科技有限公司进行菌群多样性测定，每组测定3个样本。从DNA提取到建库、测序、数据分析等均由该公司进行。首先，基于Illumina NovaSeq测序平台，利用双末端（paired-end）测序的方法，构建小片段文库进行测序；其次，使用Trimmomatic v0.33软件和cutadapt v1.9.1软件进行去引物质量过滤；使用Usearch v10软件，通过overlap对每个样品的去引物序列进行拼接和长度过滤；最后，使用QIIM E2软件中的Dada方法去噪并去除嵌合体序列，进行物种注释及丰度分析。

1.5 数据分析

通过Statistica 17.0软件对试验数据加以分析处理，所得结果先通过单因素方差分析(one-way ANOVA)法进行处理，然后对其组间差异情况通过LSD以及Duncan’s检验法进行检测。

2.1 珍珠龙胆石斑鱼生长性能的测定结果

由表1可知，各组成活率均为100%。随着黑水虻投喂比例的增加，珍珠龙胆石斑鱼的末体重、增重率、脏体比、肝体比呈下降趋势。其中末体重、增重率、脏体比在E组和H组之间差异不显著（P>0.05），但均显著高于xC组（P<0.05）；3组间肝体比差异不显著（P>0.05）。

2.2 珍珠龙胆石斑鱼肠道消化酶活性的测定结果

由表2可知，各组之间前肠、中肠、后肠中脂肪酶活性差异不显著（P>0.05）；随着黑水虻投喂比例的增加，前肠、中肠、后肠的淀粉酶活逐渐减小，各组之间差异显著（P<0.05）；前肠中E组蛋白酶活性显著高于xC、H组（P<0.05），xC、H组间差异不显著（P>0.05），中肠、后肠中E、H组蛋白酶活性显著高于xC组（P<0.05），E、H组间差异不显著（P>0.05）。

2.3 珍珠龙胆石斑肝脏生化指标的测定结果

由表3可知，E、xC组肝脏中SOD活性、T-AOC显著低于H组（P<0.05），E、xC组之间肝脏SOD活性、T-AOC差异不显著（P>0.05）。H组肝脏中MDA含量最低，且显著低于E、xC组（P<0.05），E、xC组之间MAD含量差异不显著（P>0.05）。E、xC组肝脏中酸ACP、AKP活性显著低于H组（P<0.05），E、xC组肝脏ACP、AKP活性差异不显著（P>0.05）。

2.4 珍珠龙胆石斑肠道健康菌群的测定结果

2.4.1 OTU样本分析

Venn图可用于统计多个样本中所共同拥有和单独拥有的OTU数量，可以比较直观地表现环境样本在不同的分类学水平上的构成相似性及重叠情况。由图1分析可知，xC、H、E组石斑鱼肠道菌群可操作分类单元分别划分为2 040、1 646、1 641个OTU。xC、H、E组检测到共有409个OTU，其中xC组中检测到特有OTU 786个、H组中检测到特有OTU 879个、E组中检测到特有OTU 503个。在珍珠龙胆石斑鱼的肠道菌群多样性层面进行对比分析，xC组的肠道菌群生物多样性高于H、E组。

2.4.2 肠道微生物多样性指数分析

由表4可知，测序组的覆盖率都为99.9%，因此测序结果可代表出石斑鱼的肠道内容物中微生物的真实情况。xC组与H、E组对比，Shannon指数提高了17.8%、4.4%，Ace指数提高了10.0%、4.2%；Chao指数提高了9.3%、3.4%；而Simpson指数xC组比H组降低了50.6%、比E组升高了16.7%。

2.4.3 肠道菌群的组成

由在珍珠龙胆石斑鱼肠道样品门水平聚类树与柱状图组合分析图可知（图2），xC组与H、E组菌落组成主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）构成，其中变形菌（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）为优势菌门。在图中可直观看出xC组E组菌落组成最为相似。

黑水虻的幼虫含有各种必需氨基酸和矿物质，营养价值高，可作为优质的蛋白质饲料。黑水虻体内含粗蛋白约40%，粗脂肪约30%,粗灰分约15%，粗纤维约10%，氨基酸含量相对均衡，与鱼粉类似。本试验中xC组的珍珠龙胆石斑的末体重、增重率显著降低（P<0.05），抑制了石斑鱼的生长，同时E组和H组之间差异不显著（P>0.05），这可能由于是黑水虻的营养成分不能被完全吸收。同时随着投喂黑水虻的比例增大，脏体比逐渐减少，E组和H组显著高于xC组（P<0.05）。当试验中出现鱼类脏体比数值较大时，可能是鱼类的脏器受到破坏，导致中毒。本试验结果与李景龙等[4]、胡俊茹等[11]研究用黑水虻替代饲料对于鹦鹉鱼和黄颡鱼的生产影响结果类似。在正常情况的条件下，脏器系数一般都会保持相对恒定。随着投喂黑水虻的比例增大，脏体系数逐渐减少，E组和H显著高于xC组（P<0.05）。说明黑水虻不可完全代替海水鱼配合饲料投喂珍珠龙胆石斑鱼。

鱼体内的消化酶活性与饵料中营养成分含量密不可分。鱼类蛋白酶活性受饵料中蛋白质含量影响[12]，从而影响鱼类摄食以及生长[13]。本试验结果表明，珍珠龙胆石斑鱼中肠、后肠中xC组中蛋白酶活性显著低于E组和H组（P<0.05）。一般鱼类蛋白酶活性的增加与其生长呈正相关，而本试验中xC组的增重率显著低于E组和H组（P<0.05）。鱼体消化道中淀粉酶活性与饲料中的淀粉含量呈正相关趋势[14]，在本试验中淀粉酶活性xC组活性最低，显著低于E组和H组（P<0.05）。逯尚尉等[12]采用配合饲料、鱼肉、混合饵料饲喂点带石斑鱼的研究表明，各组之间脂肪酶活性差异不显著(P>0.05)，与本试验结果一致。

SOD、T-AOC和MDA是反映机体抗氧化能力的重要指标。本试验结果表明，H组SOD活性和T-AOC活性都显著高于E、xC组（P<0.05），且其MDA含量最低，显著低于E、xC组（P<0.05）。这与黑水虻幼虫粉替代鱼粉对鲈鱼的影响研究结果[15]相似。综上所述，适当的冰鲜黑水虻可以提高珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肝脏的SOD活性和T-AOC活性并降低MDA水平，从而增强鱼体的抗氧化能力。说明投喂冰鲜黑水虻能对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肝脏抗氧化能力方面产生有益的影响。黑水虻幼虫对欧洲鲈鱼和锦鲤抗氧化能力的影响结果表明，用黑水虻可以提高锦鲤机体的抗氧化能力和非特异性免疫[16]。本试验中H组的ACP、AKP的活性显著高于E、xC组（P<0.05），表明适当投喂冰鲜黑水虻会提高珍珠龙胆石斑鱼幼鱼肝脏的ACP、AKP活性，对其非特异性免疫起促进作用。

肠道菌群有规律的生长于鱼体肠道内，在正常情况表现不致病，对机体有益无害[17]。本试验中Coverage指数在各组中均为99.9%，说明各组样品均达到测序要求，能够反映肠道菌群Ace和Chao代表微生物群落的丰富性，数值越大代表生物群落丰度越高[18]。本研究发现，xC组中特有OTU高于E组，肠道微生物群落的丰度和多样性显著提高，说明冰鲜黑水虻能改变试验鱼的肠道菌群的组成。有报道指出厚壁菌门(Firmicutes)细菌减少是肠道炎症的主要表现之一[19]。本试验结果xC组的变形菌门（Proteobacteria）丰度高于E组，而厚壁菌门（Firmicutes）丰度则是E组高于xC组。在目水平上各组的优势菌目为假单胞菌目（Pseudomonadales），同时不动杆菌属（Acinetobacter）丰度在逐渐增加。说明黑水虻可能通过调节的肠道菌群的组成，进而影响了肠道炎症的状态。陈延娜等[9]研究黑水虻油替代豆油对草鱼生长性能、抗氧化能力和肠道菌群的影响结果中出现与本研究类似的结果。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2023，44（14）：7-12

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