人工瘤胃液渗透压、pH、挥发性脂肪酸（VFAs）浓度对绵羊瘤胃上皮VFAs吸收的影响

随着人们物质生活水平的提高，对肉、奶等动物蛋白类制品的需求和品质要求也在相应提升。集约化养殖模式下，养殖场（户）通常为追求高产而制定高精料饲粮方案。对于反刍动物，这类饲料含有丰富的碳水化合物，在瘤胃内发酵产生大量挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），导致瘤胃内pH降低，造成反刍动物瘤胃酸中毒[1]。瘤胃酸中毒是反刍动物生产中常见的消化代谢疾病[2]。若瘤胃内长期pH过低，可能会导致瘤胃炎症[3]、瘤胃角质化、蹄叶炎、腹泻的发病率升高，还会引起瘤胃内有害微生物滋生，产生大量毒素，通过血液循环系统进入肝脏，损害肝脏健康。依靠瘤胃厌氧微生物将碳水化合物降解为VFAs后再吸收是反刍动物特有的消化特点[4]。瘤胃中的VFAs主要是C2～C6 脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸等挥发性脂肪酸。乙酸、丙酸、丁酸约占瘤胃发酵挥发性脂肪酸总量的95%左右，有研究结果显示，瘤胃酸中毒对VFAs 组分中的乙酸、丙酸、丁酸水平影响最显著[5]。

以往对瘤胃酸碱平衡调控的研究仅重视了唾液的中和作用，在咀嚼次数与中性洗涤纤维（NDF）关系、咀嚼次数与唾液分泌关系及瘤胃VFAs 产量预测方面进行了深入研究，并建立预测方程[6]。但对VFAs在瘤胃内的吸收、VFAs 随内容物外流和瘤胃壁碳酸分泌尚缺乏系统研究。目前认为，pH、渗透压、VFAs浓度等因素都会影响VFAs在瘤胃内的吸收[7-10]，已有的试验集中于对这些因素的定性研究，定量研究较少。因此，本试验以4 只雌性杜泊绵羊为试验动物，通过单因素处理的方法，探究瘤胃液pH、瘤胃液渗透压、瘤胃液挥发性脂肪酸浓度这3 个因素是如何分别影响瘤胃上皮对VFAs 的吸收，并分别提出各自影响VFAs 吸收的预测方程，以期为预防反刍动物瘤胃酸中毒、科学利用优质粗饲料提供一定的理论参考。

1.1 试验动物与试验设计

本试验使用4 只带有瘤胃小胃的雌性绵羊，年龄2 岁，体重（45±5）kg。日粮精料为粉碎玉米、豆粕，粗料为花生秧。精粗比为45∶55。日供料两次（6:00 和18:00），饮水自由。预试期15 d 实施瘤胃小胃手术，该手术来源于著名的巴甫洛夫小胃。巴甫洛夫小胃是在主胃的基础上分隔出一个小胃封闭腔室[11]。小胃与瘤胃并不是完全分离，而是将小胃黏膜层与瘤胃体完全分离，肌肉层和浆膜层不分离，然后将切口缝合起来形成小胃，瘤胃可以为小胃提供血液和神经支配[12]。另外，使用瘤胃小胃技术可以避免唾液和瘤胃液外流的影响，可以比较单纯地研究瘤胃上皮对VFAs 的吸收过程。手术后注射青霉素、链霉素，然后再注射鹿醒灵2 号让手术羊慢慢苏醒。术后连续7 d静脉注射抗生素，防止感染。术后绵羊禁食36 h，少量饮水；每天用0.1%苯扎溴铵溶液清洗瘤胃小胃。术后15～20 d，小胃愈合基本完成，待试验动物完全恢复健康后即可投入试验使用。

动物机体处于正常情况下瘤胃内容物渗透压为260～340 mOmsm/L，pH 为5.5～7.5，因此本试验设计分别取二者的中间值即渗透压300 mOmsm/L、pH 6.0 作为另外两个因素改变时的固定值[13-14]。pH 为6.0 时，VFAs 的吸收速率为乙酸<丙酸<丁酸，且乙酸的吸收速度在浓度为 50 mmol/L时最大[15]，因此，为了计算的便捷性，将接近乙酸最大吸收速度时的浓度54 mmol/L作为另外两个因素改变时乙酸浓度的固定值，按照乙酸∶丙酸∶丁酸为6∶3∶1 的比例计算出丙酸浓度为27 mmol/L，丁酸为9 mmol/L。

本试验就瘤胃液挥发性脂肪酸浓度、瘤胃液pH、瘤胃液渗透压3 个影响因素分别进行单因素试验处理，研究其中1个因素时另外2个因素固定。3个因素各有7 个梯度，共21 个试验处理，每组处理中的4 只雌性杜泊绵羊作为平行重复。具体处理见表1。21 个试验处理对4 只绵羊进行平行灌注。由表2和表3可知，21个试验处理中VFAs浓度梯度通过控制添加VFAs的量实现；pH梯度通过添加氢氧化钠和盐酸调节；渗透压梯度通过控制氯化钠的添加量进行调节。

表2 pH试验处理

表3 VFAs浓度试验处理（mmol/L）

1.2 灌注与采样

每天早上8：00 开始，先用配置好的人工瘤胃液（水温36 ℃）对小胃润洗3遍，然后快速通过小胃导管向小胃内灌注人工瘤胃液120 mL，灌注完毕后用夹子沿绵羊体壁将小胃导管夹住，防止液体外流。

每次灌注试验中，在向小胃灌注人工瘤胃液之前取50 mL 溶液作为0 时刻的样品，在向小胃灌注人工瘤胃液10 min 后全部取出小胃内的人工瘤胃液并取样50 mL，作为10 min 时刻的样品，然后再重新灌注 新 的人工瘤胃液。同样在20、30、40、50、60、70、80、90 min 时刻，采用与10 min 时刻相同的操作。每次灌注试验共采样10 次，样品采集后立即测定溶液pH，然后放入冷冻冰箱（-20 ℃）保存，待测定VFAs 浓度。每次试验完毕后，羊只休息3 d。

1.3 测定指标及方法

灌注液pH 使用UB-7型pH 计测定。渗透压使用德国Gonotec OSMOMAT 030 型渗透压计测量。挥发性脂肪酸浓度使用气相色谱仪(Shimadzu,GC-17A，日本岛津公司）进行测定。瘤胃液样品解冻后，取2 mL于5 mL 离心管中，使用4 ℃离心机10 000 r/min 离心10～15 min，再取离心上清液1 mL于1.5 mL离心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液（按照5∶1 的比例），用涡漩振荡器混合均匀，再以10 000 r/min 离心10～15 min，取上清液。VFAs标准液为乙酸0.000 35 g/mL、丙酸0.000 331 g/mL、丁酸0.000 319 5 g/mL。色谱条件为色谱柱为4 mm×2 m 玻璃柱，内部填充物质为3%硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇（FFAP）。柱温140 ℃，汽化室温度200 ℃，氢火焰离子化检测器（FID）温度180 ℃。载气使用氮气，流速为40 mL/min；氢气流速为50 mL/min；氧气流速为50 mL/min；样品进样量为1 µL。

样品VFAs 浓度=标准液VFAs 浓度×样品峰面积/标准液峰面积分别将0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min 时刻对应的人工瘤胃液中VFAs 的浓度乘以灌注体积，即可得到对应时刻的人工瘤胃液中VFAs 的物质的量，通过使用软件进行分析，拟合方程。然后对方程进行求导，导函数在0 h 的值就是0 h 小胃内VFAs 的绝对吸收速度。本试验最终需要得到的是单位有效吸收面积VFAs绝对吸收速度。

单位有效吸收面积VFAs 绝对吸收速度=VFAs 绝对吸收速度/小胃有效吸收面积

1.4 数据统计与分析

本试验采用一般线性模型对VFAs的总量在小胃内的变化过程进行拟合。对得到的线性方程求导函数，得到的值就是次试验处理条件下VFAs 在0 h的绝对吸收速度。

3 个因素各个梯度下的单位有效吸收面积VFAs绝对吸收速度数据得到后，应用SPSS 统计软件对数据进行变异系数（CV）分析，CV<12%表示平均值代表性较好，否则表示平行数据围绕均值离散度较大，均值代表性较差。

2.1 瘤胃小胃有效吸收面积

4 只绵羊屠宰后取其小胃，使用查表格法测量其有效吸收面积（见表4）。

2.2 渗透压对VFAs吸收速度的影响

2.2.1 总VFAs的吸收速度

根据表5 可知，随着人工瘤胃液渗透压升高，4 只羊瘤胃内渗透压升高，4只羊瘤胃内总VFAs的吸收速度在下降。每个渗透压试验处理中，4只羊总VFAs吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个渗透压梯度下的总VFAs 吸收速度，人工瘤胃液渗透压在240～360 mOmsm/L，总VFAs 的吸收速度曲线（见图1）方程为y =117.233e-0.005x，R2=0.976。y 为单位有效吸收面积总VFAs 的吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x 为瘤胃液渗透压(mOmsm/L)。

表5 不同渗透压条件下总VFAs的吸收速度

2.2.2 乙酸的吸收速度

根据表6 可知，随人工瘤胃液渗透压不断升高，4 只羊瘤胃内乙酸的吸收速度下降，而且下降趋势逐渐加快。每个渗透压试验处理中，4 只羊乙酸吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个渗透压梯度下的乙酸的吸收速度，人工瘤胃液渗透压在240～360 mOmsm/L，乙酸的吸收速度曲线（见图1）方程为y=74.951e-0.006x，R2=0.873。y为单位有效吸收面积乙酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液渗透压(mOmsm/L)。

2.2.3 丙酸的吸收速度

根据表7 可知，随人工瘤胃液渗透压升高，4 只羊瘤胃内丙酸的吸收速度下降，但下降趋势逐渐趋于平缓。每个渗透压试验处理中，4 只羊丙酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个渗透压梯度下的丙酸的吸收速度，人工瘤胃液渗透压在240～360 mOmsm/L，丙酸的吸收速度曲线（见图1）方程为y=28.331e-0.005x，R2=0.677。y 为单位有效吸收面积丙酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液渗透压（mOmsm/L）。

2.2.4 丁酸的吸收速度

根据表8 可知，随人工瘤胃液渗透压升高，4 只羊瘤胃内丁酸的吸收速度下降，但下降趋势逐渐趋于平缓。每个渗透压试验处理中，4只羊丁酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个渗透压梯度下的丁酸的吸收速度，人工瘤胃液渗透压在240～360 mOmsm/L范围内，丁酸的吸收速度曲线（见图1）方程为y=13.695e-0.005x，R2=0.677。y为单位有效吸收面积丁酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液渗透压（mOmsm/L）。

2.3 pH对VFAs吸收速度的影响

2.3.1 总VFAs的吸收速度

根据表9 可知，随人工瘤胃液pH 升高，4 只羊瘤胃内总VFAs 的吸收速度逐渐下降。每个pH 试验处理中，4 只羊总VFAs 吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个pH梯度下的总VFAs 的吸收速度，人工瘤胃液pH 为5.0～8.0，总VFAs 的吸收速度曲线（见图2）方程为y=243.765e-0.364x,R2=0.931。y 为单位有效吸收面积总VFAs吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液pH。

表9 不同pH条件下总VFAs的吸收速度

2.3.2 乙酸的吸收速度

根据表10 可知，随人工瘤胃液pH 升高，4 只羊瘤胃内乙酸的吸收速度逐渐下降，而且下降趋势加快。每个pH 试验处理中，4 只羊乙酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个pH 梯度下的乙酸的吸收速度，人工瘤胃液pH 为5.0～8.0，乙酸的吸收速度变化曲线（见图2）方程为y=212.905e-0.422x,R2=0.857。y 为单位有效吸收面积乙酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x 为瘤胃液pH。

2.3.3 丙酸的吸收速度

根据表11可知，随人工瘤胃液pH升高，4只羊瘤胃内丙酸的吸收速度逐渐下降。每个pH试验处理中，4只羊丙酸吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7个pH梯度下的丙酸的吸收速度，人工瘤胃液pH为5.0～8.0，丙酸的吸收速度曲线（见图2）方程为y=41.040e-0.282x，R2=0.858。y为单位有效吸收面积丙酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液pH。

2.3.4 丁酸吸收速度

根据表12 可知，随人工瘤胃液pH 升高，4 只羊瘤胃内丁酸的吸收速度逐渐下降。每个pH 试验处理中，4 只羊丙酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个pH梯度下的丁酸的吸收速度，人工瘤胃液pH为5.0～8.0，丁酸的吸收速度曲线（ 见图2）方程为y = 19.637e-0.324x，R2=0.937。y 为单位有效吸收面积丁酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液pH。

2.4 VFAs浓度值对VFAs吸收速度的影响

2.4.1 总VFAs的吸收速度

根据表13 可知，随瘤胃液VFAs 浓度升高，总VFAs 的吸收速度也升高。每个总VFAs 浓度试验处理中，4 只羊总VFAs 吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个总VFAs 梯度下的总VFAs 的吸收速度，总VFAs浓度为50～170 mmol/L，总VFAs 的吸收速度曲线（见图3）方程为y = 29.350 ln( x) - 102.990，R2=0.948。y为单位有效吸收面积总VFAs吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液总VFAs浓度（mmol/L）。

表13 不同VFAs浓度条件下总VFAs的吸收速度

2.4.2 乙酸吸收速度

根据表14 可知，随瘤胃液乙酸浓度升高，乙酸的吸收速度也升高。每个乙酸浓度试验处理中，4只羊乙酸吸收速度的变异系数均小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7个乙酸梯度下的乙酸的吸收速度，乙酸浓度为30～102 mmol/L，乙酸的吸收速度曲线（见图3）方程为y=12.491ln(x)-33.813，R2=0.978。y 为单位有效吸收面积乙酸吸收速度[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液乙酸浓度（mmol/L）。

2.4.3 丙酸的吸收速度

根据表15 可知，随瘤胃液丙酸浓度升高，丙酸的吸收速度也升高。每个丙酸浓度试验处理中，4 只羊丙酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个丙酸梯度下的丙酸的吸收速度，丙酸浓度为15～51 mmol/L，丙酸的吸收速度曲线（见图3）方程为y=12.581ln(x)-32.098，R2=0.861。y 为单位有效吸收面积丙酸吸收 速 度[µmol/(h·cm2)]；x 为 瘤 胃 液 丙 酸 浓 度（mmol/L）。

2.4.4 丁酸的吸收速度

根据表16 可知，随瘤胃液丁酸浓度升高，丁酸的吸收速度也升高。每个丁酸浓度试验处理中，4 只羊丁酸吸收速度的变异系数绝大部分小于10%，这说明平均值的代表性较好。通过分析7 个丁酸梯度下的丁酸的吸收速度，丁酸浓度为5～17 mmol/L，丁酸的吸收速度曲线（见图3）方程为y = 4.275 ln( x) - 5.705，R2=0.923。y 为单位有效吸收面积丁酸吸收速度，[µmol/(h·cm2)]；x为瘤胃液丁酸浓度（mmol/L）。

3.1 渗透压对VFASs吸收的影响

瘤胃液渗透压的产生是由于瘤胃内日粮发酵产生的挥发性脂肪酸、乳酸、葡萄糖、矿物质等溶于水后造成的。国内一项研究表明，瘤胃液渗透压和瘤胃液外流速度之间呈正相关[16]，高渗透压条件下，瘤胃液外流速度加快，VFAs 随瘤胃液外排，导致瘤胃内VFAs 总量减少，再加上水分从血液向瘤胃内转移，势必会造成瘤胃内VFAs浓度降低，影响VFAs吸收。本试验研究结果发现，总VFAs、乙酸、丙酸、丁酸单位有效吸收面积的绝对吸收速度都随着渗透压的升高而降低，这与已有的研究报道渗透压的升高对VFAs 吸收有抑制作用的结果一致[17]。高渗透压抑制VFAs 的吸收的原因可能有以下几个方面：当反刍动物采食过量精料日粮，瘤胃渗透压升高，当高于瘤胃上皮血液中渗透压时[18]，由于存在渗透压差所以导致血液中的大量水分透过瘤胃上皮进入瘤胃，由于瘤胃内存在较多的水分从而会造成瘤胃上皮乳头肿胀，严重时会导致瘤胃上皮脱落，破坏瘤胃壁正常生理结构[19]，瘤胃壁结构受损势必会抑制VFAs 的吸收。另一原因可能是瘤胃上皮血流在VFAs 吸收过程中发挥重要作用[20]，在较高瘤胃渗透压环境下，水分从瘤胃上皮血液中向瘤胃内渗透，而瘤胃上皮吸收瘤胃中VFAs 时需要克服静水压力，所以不利于VFAs 的吸收。还有一种可能的原因是当瘤胃液渗透压低于瘤胃上皮血液渗透压时，瘤胃内的水分会被瘤胃上皮吸收[21]，导致瘤胃内VFAs 的浓度升高。VFAs 的浓度越高，其绝对吸收速度越快，因此低的渗透压有利于VFAs 的吸收。瘤胃高渗透压环境对VFAs 的吸收有抑制作用，但其具体的作用机制还需要进一步研究和探索。

3.2 pH对VFAs吸收的影响

诸多研究结果表明，瘤胃上皮对3 种主要VFAs的吸收速度受到瘤胃液pH 的影响。已有的研究认为，VFAs 很大程度上是依靠被动扩散被瘤胃上皮吸收的[22]，而且只有酸性形式的VFAs 才能依靠被动扩散被瘤胃上皮吸收，其理论依据是未解离的酸性形式VFAs 可以通过瘤胃上皮细胞的磷脂双分子层[23]，而离子形式的VFAs不能被动扩散进入瘤胃上皮。Melo等[24]的研究似乎也证实了这一点，当瘤胃内pH>7时，不利于VFAs 的吸收。本试验在其他条件恒定，pH 为5～8 时，瘤胃上皮对VFAs 的吸收速率随pH 的升高而下降，与前人的试验结果一致。但是根据Henderson-Hasselbalch 方程可知,瘤胃内的VFAs 全部都是以离子形式存在时，仍然能够观察到有大量的VFAs吸收，原因可能是在瘤胃内pH 较高时，瘤胃上皮可以向瘤胃内分泌酸，为离子形式的VFAs提供氢离子，用来形成酸性形式的VFAs，然后通过被动扩散的形式被瘤胃上皮吸收。因此，离子形式的VFAs 需酸化后才能被吸收，所以相比于酸性形式VFAs，离子形式VFAs的吸收机制更为复杂。因此，瘤胃内pH 大小决定了酸性形式VFAs 与离子形式VFAs 的浓度和所占瘤胃内总VFAs 的比例。pH 越低，酸性形式的VFAs 比例越高，被动扩散越活跃，总体VFAs 的吸收速度也越快。因此，pH 大小决定了溶质的浓度进而影响其扩散速度。

本试验所得预测方程仅适用于pH 为5.0～8.0，如若pH 范围继续扩大，吸收速度变化趋势可能与曲线方程拟合的曲线不一致。若pH 低于5.0或者更低，可能会造成瘤胃酸中毒，损坏瘤胃上皮完整性，最终造成VFAs 吸收速度降低。因此，低pH 有利于VFAs 的吸收这一结论仅适用于在瘤胃可承受的pH 范围内，过低或者过高都会影响瘤胃上皮VFAs的吸收速率。

3.3 VFAs浓度对VFAs吸收的影响

在瘤胃正常pH 条件下，酸性形式的VFAs浓度较高，因此VFAs 主要通过被动扩散形式被瘤胃上皮吸收，所以在正常pH 范围内酸性VFAs 的浓度是影响VFAs 吸收速度的主要因素之一。离子形式的VFAs可以通过瘤胃上皮细胞膜上的阴离子转运载体，在向瘤胃上皮细胞转运入一个离子形式VFAs 的同时，通过协助扩散的方式向瘤胃内转运出一个碳酸氢根离子[25]。在一定的溶质浓度范围内，协助扩散的速度会随着溶质浓度的增加而升高。因此，无论是酸性形式或者离子形式VFAs 的吸收，在一定范围内，VFAs 吸收速度会随着VFAs浓度的增加而升高。早期有研究在适当的范围内，VFAs 的绝对吸收速度会随着VFAs浓度增加而升高[15]，这与本试验所得结果一致。本试验在pH 和渗透压恒定的情况下，瘤胃内VFAs的吸收速率与VFAs 浓度呈正相关。Ahmad 等[26]的研究在转录水平上也证实了这一点，增加日粮能量水平可提高瘤胃上皮细胞中VFAs 转运基因的表达，其原因也是日粮能量水平的增加导致了瘤胃内VFAs 浓度的升高，促进瘤胃上皮对VFAs的吸收。

本试验所得VFAs 吸收曲线均是在瘤胃液pH、渗透压不变，VFAs 浓度变化条件下获得的。通过这些曲线方程能够了解在VFAs 适宜浓度范围内，单纯的浓度变化对VFAs 的吸收速度的影响规律。然而，在真实的瘤胃内，VFAs 浓度的升高往往会伴随着pH 下降[27-28]，渗透压上升。这就导致VFAs 浓度对VFAs 吸收的影响规律发生改变。若VFAs 浓度过高，导致的pH 过低，渗透压过高则可能会破坏瘤胃上皮结构[29]，最终抑制VFAs的吸收。

本试验研究瘤胃液pH、渗透压、VFAs 浓度分别对VFAs 吸收的影响。在渗透压为240～360 mOmsm/L时，瘤胃液渗透压升高对VFAs的吸收有抑制作用；在pH 为5.0～8.0 时，瘤胃液pH 的升高不利于VFAs 的吸收；在总酸浓度为50～170 mmol/L 时，瘤胃液VFAs 浓度升高，可以促进VFAs 的吸收。然而在真实的瘤胃内环境中，这3 个因素是互相交叉影响VFAs 的吸收。因此，后续的研究可以将3 个影响因素对VFAs 吸收的预测方程进行结合，再通过3 因素交叉影响下测得的试验数据进行修正，得到3个因素交叉影响下VFAs的吸收速度预测方程。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2025，46（7）：85-95

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