黑水虻抗菌肽在动物养殖中应用的研究进展

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一种广泛存在生物体内且对致病微生物有抑制或杀灭作用的小肽。AMPs 最初在昆虫中发现，在其先天免疫系统发挥着重要作用。大多数AMPs 是由20～50 个氨基酸残基组成的小分子活性肽，同一类的AMPs在不同种类昆虫中表现出不同的生物学特性，但其共同特征具有线性或环状的阳离子结构[1-2]。这类AMPs 具有良好的抗菌、抗肿瘤功能，此外，昆虫AMPs 来源丰富、稳定性好，有望成为新型抗生素替代物[3]。

黑水虻（black soldier fly，BSF）是隶属于双翅目（Diptera）、短角亚目（Brachycera）、水虻科（Stratiomyidae）、扁角水虻属（Hermetia）的一种昆虫，它能迅速寄生在废弃物中并分解营养成分，如餐厨垃圾[4]、粪便[5]，生产出高营养的昆虫蛋白。黑水虻幼虫对废弃物分解的种类和消耗效率均高于果蝇、蜜蜂和家蚕[6]。黑水虻能在极端的环境中生存，这表明黑水虻可以产生多种保护自身的物质，如AMPs，保护其不被细菌、真菌和病毒的侵染[7]。近年来，黑水虻AMPs 因高效抗菌成为研究热点。文章主要综述了黑水虻AMPs的作用机制、种类的多样性和提取方法，以及在动物养殖中应用的研究进展，以期为黑水虻AMPs 在养殖业的应用提供参考。

黑水虻AMPs 通常以胞外作用来完成。AMPs 的结构多样，其生物学机制与破坏细菌的细胞膜有关[8]。AMPs 作用细菌时首先接触细胞壁，细胞壁主要起到维持细菌形态和保护细菌不被外界侵入。绝大多数AMPs含有阳离子结构，可与带阴离子的脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA）结合，从而改变细菌细胞壁表面的电位平衡，穿过细胞壁破坏其正常结构[9]。细胞壁结构被破坏后，部分AMPs 最终会通过形成离子通道或跨膜孔来破坏细胞膜的完整性，引发细胞内容物的泄漏，从而杀灭细菌[10]。细胞膜裂解的具体作用机制可分为4 种模型：桶壁孔模型、非结构环孔模型、地毯状孔模型、环形孔模型[11]（见图1）。

桶壁孔模型中，AMPs与细胞膜结合，进入磷脂双分子层的疏水中心，导致细胞内物质渗出、膜电位降低，通过这种机制破坏细胞膜的AMPs 有角朊毒素[12]和两性霉素B[13]，最终导致细胞死亡。非结构环孔模型中，由于AMPs排列成环状结构，以不同角度附着在细胞膜上，导致细胞膜损伤。地毯状孔模型中，AMPs以地毯状的方式覆盖细胞膜，这种机制需要高浓度的AMPs 导致细胞膜裂解。研究表明，天蚕素能通过溶解细胞膜形成孔道抑制绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长[14]。细菌脂质双分子层上的AMPs持续积累会在膜表面形成“地毯状”结构，导致细菌细胞膜的破坏[15]。环形孔模型中，AMPs 垂直于脂质双层排列，诱导局部弯曲，形成的孔由AMPs和磷脂组成[16]，由此产生的脂质AMPs 模型称为“环形孔”，这种结构可以溶解细胞膜。

此外，细胞内杀伤机制是另一种作用方式，AMPs穿过细胞膜进入胞质，通过扰乱胞内靶点结合等方式杀灭细菌。黑水虻防御素肽2（DLP2）和防御素肽4（DLP4）与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）结合，破坏其α-螺旋结构，进而抑制DNA、RNA 和细胞壁等生物大分子的正常合成[17]。

目前，已鉴定的AMPs种类繁多，其分类一般以二级结构为基础，AMPs 数据库收录的2 800 多种AMPs中，来自昆虫的AMPs 约占10%[17]。昆虫AMPs 的氨基酸序列和结构特征被定义四大类：①α-螺旋肽（如天蚕素cecropins）；②富含半胱氨酸的肽（如防御素defensin）；③富含甘氨酸的肽（如攻击素attacin）；④富含脯氨酸的肽（如蜜蜂肽apidaecin）[18]。天蚕素和防御素是黑水虻中常见的AMPs，从黑水虻中分离鉴定出的部分AMPs见表1。

表1 黑水虻AMPs的分类

防御素含有多个保守的半胱氨酸，是黑水虻中种类最多的AMPs[24]。昆虫防御素包含一个n 端环、一个反向平行β-折叠和一个α-螺旋，形成一个稳定的半 胱氨酸αβ 结构[25]。研究表明，黑水虻DLP2 和DLP4 形成典型的CS-αβ 结构，对MRSA 具有显著的抗菌作用，可提高MRSA 攻毒小鼠的存活率[17]。天蚕素是黑水虻AMPs 中研究最多的一类，最常见的是天蚕素A、B和D，它们是由约35个不含半胱氨酸残基组成的小肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很好的抑制效果，其中，天蚕素B 在整个天蚕素家族中表现出最高的抗菌活性[26]。天蚕素A、B、D 和抗生素干预大鼠感染性休克模型的结果显示，天蚕素B 可以显著降低大肠杆菌的数量和血液中内毒素含量，降低大鼠死亡率[27]。黑水虻AMPs的天蚕素家族对大肠杆菌具有抑制作用，含有n 端螺旋的CLP1 在大肠杆菌中的活性比氨苄西林高50 倍，AMPs 的n 端一级结构可能对抗菌功能起重要作用[22]。

目前，黑水虻AMPs主要是从幼虫体内直接提取，这种方法也是实验室常用的提取方法之一。近年来，随着工业化的发展，基因工程技术应用领域逐步扩大，通过预测新型AMPs基因，运用分子生物学技术重组表达黑水虻AMPs成为新的提取方法。

3.1 直接提取法

黑水虻幼虫经过诱导处理可以产生天然AMPs，用溶剂提取法或血淋巴法可从虫体体内直接提取。利用浸提法提取黑水虻幼虫，提取物浓度在325 mg/mL 对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色假单胞菌有较强的抑制效果，抗菌活性物质可能是黑水虻幼虫中的AMPs[28]。利用金黄色葡萄球菌诱导5 日龄黑水虻幼虫，使用Sep-Pack C18色谱柱进行固相萃取和反向色谱分离纯化出新型防御素，DLP4 对革兰氏阳性菌显示出良好的抗菌活性[19]。用干酪乳杆菌针刺诱导5 日龄黑水虻幼虫，经微波干燥乙酸处理的提取物对沙门氏菌具有良好的抑制效果且不产生细胞毒性[29]。直接提取法操作简单，常用于AMPs粗提物的提取，但这种方法提取容易减少AMPs 的种类，对AMP 造成不同程度的失活。直接提取分离得到的黑水虻AMPs产量低，杂蛋白含量多，需要对其进行纯化，如高效液相色谱法（HLPC）[30]、凝胶层析法[31]。

3.2 生物技术法

近年来，利用生物技术制备黑水虻AMPs 成为热门研究，有关黑水虻AMPs基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等表达系统中的表达开展大量工作。研究表明，构建重组质粒pGEX-4T-1/Defensin，转入大肠杆菌BL21，表达产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有较好的抑制效果[32]。Z编码了6 种黑水虻防御素（hidefensin1-1，2，3，4，5，6），其中hidefensin1-1 作为与硫氧还蛋白的融合蛋白在大肠杆菌BL21 中成功表达，经纯化的TRX-Hidefensin1-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑制效果[20]。在毕赤酵母表达系统中表达了黑水虻防御素DLP2 和DLP4，产率分别为873.5 mg/L 和801.3 mg/L，对MRSA 有较强的抑菌活性[17]。构建含有DLP4、SMFP 和CAD 3 段AMPs 基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵上清液对大肠杆菌有明显的抑制效果[33]。重组AMPs 有利于纯化和工业生产的优点，可以通过改变表达系统收获高产量、高纯度的AMPs。

化学合成法由于产量低、合成难度大，易产生有毒副产物，规模化生产昂贵，难以应用到工业生产。

目前，黑水虻的市场潜力和研究价值巨大，黑水虻幼虫粉作为蛋白饲料已经大量应用于动物养殖，而且黑水虻中的AMPs具有抗菌谱广、稳定性好等特点，在养殖业中应用有助于提高动物的生产性能，减少疾病的发生。

4.1 在家禽中的应用

家禽是养殖业中最大的群体，在禁抗大环境下，天然AMPs 的应用可以极大缓解家禽养殖中的痛点。研究表明，日粮中添加12.5%和25.0%的黑水虻幼虫粉对肉鸡盲肠菌群无显著影响，并且不会富集特定抗生素的耐药基因[34]。日粮中添加3%的黑水虻幼虫粉不影响番鸭的微生物菌群，过量添加可能导致挥发性化合物的转移[35]。由于黑水虻幼虫粉AMPs 的存在，适量添加有助于胃肠道的发育并抑制肠道中的病原微生物，从而增强肠道平衡。肉鸽饲粮中添加200 mg/kg 抗菌肽microcin J25，乳鸽抗氧化能力和肠道屏障功能增强，促进肠道菌群调节，改善乳鸽的羽毛[36]。产气荚膜梭菌是诱导肉鸡坏死性肠炎的重要因素。肉鸡饲粮中添加抗菌肽A3，产气荚膜梭菌的排泄减少并显著改善其生长性能、肠道形态[37]。由Ⅰ型天蚕素改造成的Ⅱ型天蚕素能够显著抑制产气荚膜梭菌，在肉鸡饲料中添加Ⅱ型天蚕素显著降低坏死性肠炎的发病率[38]。

4.2 在水产中的应用

嗜水气单胞菌是水产常见的致病菌，感染后导致鱼类肠炎、败血症，虾类应急能力减弱、减少摄食。研究表明，添加1%～3%的黑水虻幼虫浆通过上调抗炎、紧密连接蛋白和增强免疫相关的酶活性来增强金鲳（Trachinotus ovatus）的免疫能力，同时增强肠道消化酶活性来促进生长，这可能与黑水虻AMPs 对其肠道微生物菌群的重建有关[39]。添加100～150 mg/kg 的黑水虻AMPs能够提高红爪鳌虾的生长性能和非特异性免疫酶活性以及增强其对嗜水气单胞菌的抵抗力[40]。用50%脱脂黑水虻幼虫粉可以成功替代鱼粉饲喂中华绒螯蟹且不会对生长性能、抗氧化能力、肠道形态和微生物菌群产生不利影响[41]。

4.3 在仔猪中的应用

断奶仔猪容易出现腹泻、生长缓慢和免疫机能下降等疾病。仔猪饲粮中添加500 mg/kg 黑水虻提取物可减轻流行性腹泻病毒诱导的新生仔猪氧化应激并激活免疫系统，改善其肠道功能和抗氧化能力[42]。仔猪饲粮中添加12%黑水虻幼虫粉改善其生长性能和营养利用率，黑水虻幼虫衍生的AMPs 在基因水平上抑制致病菌的生长，从而减少断奶后仔猪的肠道炎症并提高其抗氧化能力[43]。通过黑水虻幼虫饲喂断奶仔猪替代鱼粉和豆粕，营养物质消化率、生长性能和免疫能力均得到改善，这可能是其中AMPs 和几丁质发挥作用[44]。复合AMPs可以保护断奶仔猪避免受到饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的攻击，DON可以增强肠道通透性，损害肠绒毛，引起上皮细胞凋亡，抑制蛋白质合成[45]。复合AMPs 可以改善肠道形态，促进肠上皮细胞增殖和蛋白质合成，并增强断奶仔猪的肠道屏障功能，因此，复合AMPs作为饲料添加剂为畜禽养殖开辟新的可能性[45]。饲粮中添加500 mg/kg 的AMPs 饲喂4 周或1 000 mg/kg 的AMPs 饲喂2 周可以显著改善断奶仔猪的免疫功能[46]。

综上，黑水虻AMPs 可以在一定程度上提高动物免疫能力，促进肠道健康，抑制致病菌的生长和繁殖，大幅降低疾病的发生率。因此，低水平的黑水虻幼虫粉和黑水虻AMPs能够作为动物养殖中潜在的抗菌生长促进剂。

黑水虻AMPs 直接在动物养殖上应用较少，但黑水虻含有多种天然AMPs，通过开发新型黑水虻AMPs应用到动物养殖中，将会带来不错的应用价值和经济效益。在未来，对黑水虻AMPs 可以从以下几方面开展研究：①利用各种免疫方法诱导黑水虻产生新型AMPs，筛选出对细菌抑制效果强的AMPs；②优化出产量高、性质稳定的黑水虻AMPs的制备方法；③加大黑水虻AMPs 作为抗生素替代物在动物养殖中应用研究。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2025，46（9）：19-24

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