反刍动物瘤胃氮素利用微生物及其生产应用的研究概况

瘤胃微生物群是一个复杂的生态系统，瘤胃内氮素代谢循环是畜牧业生产需要考虑的一个重要因素。目前，有关瘤胃微生物的研究主要集中在纤维降解微生物及其代谢机制以及如何提高优化纤维素降解上[1-2]。瘤胃内蛋白质被微生物降解为氨从而合成微生物蛋白，然而瘤胃内过多的蛋白质被降解以及微生物的脱氨作用造成氨过量产生，无法被微生物利用，从而导致有一部分氮素被浪费[3]。

瘤胃细菌在蛋白质降解过程中发挥着重要作用，瘤胃氮素利用菌种的研究对于提高蛋白质利用效率至关重要。随着生物技术的发展，微生物制剂在畜牧养殖上的应用研究也越来越多，很多瘤胃功能菌通过包埋等工艺形成的产品，在养殖生产过程中具有提高氮利用效率的作用。因此，探讨并利用瘤胃微生物提升氮素利用率也许是一条有价值的途径[4-5]。

瘤胃降解蛋白（RDP）和瘤胃非降解蛋白（RUP）是饲料粗蛋白（CP）中两个功能截然不同的组分。RDP在瘤胃中降解，为微生物的生长和微生物蛋白的合成提供了所需的肽、游离氨基酸和氨。RUP是动物吸收氨基酸的第二重要来源，饲料RDP 与RUP 的科学配比是提高氮素利用效率、保障动物生长健康的基础。美国康奈尔大学的众多学者综合反刍动物营养学研究后，提出了全新的反刍动物营养价值评定体系——康奈尔净碳水化合物净蛋白质体系（Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS）[6]。 目前CNCPS 模型（v6.5）将动物饲料中的粗蛋白按其在瘤胃中的降解速度分为PA、PB 和PC 三部分（表1），PA指在瘤胃中能够被迅速降解的粗蛋白组分，PA1 为饲料粗蛋白中的非蛋白氮（NPN）组分，主要是指饲料中的尿素、磷酸铵等含氮化合物；PA2 为可溶性真蛋白组分。PC 为粗蛋白中的结合蛋白，即酸性洗涤不溶氮（ADIN），是被认为不能被降解的蛋白质。PB 为饲料粗蛋白中可被潜在降解的组分，同时按在瘤胃的降解速度又被进一步分为PB1、PB2，PB2 为溶于酸洗洗涤剂（NDIP）但不溶于中性洗涤剂（ADIP）的部分，PB2蛋白在瘤胃中的降解受饲料消化率和流通率的影响；而PB1 为饲料粗蛋白除去PA1、PA2、PB2、PC 后剩下的部分，PB1 中的一部分蛋白可在瘤胃内降解，一部分进入到肠道中。

反刍动物瘤胃内主要以蛋白质、多肽、氨基酸和尿素作为氮源供给微生物利用，根据氮源底物的不同，可以将瘤胃微生物分为不同种类，要将氮源彻底降解为氨，需要多种微生物的协同参与[7-8]。

2.1 蛋白质降解菌

蛋白降解菌中研究最多的是Ruminobacter amylophilus、Butyrivibrio fibrisolvens 和Prevotella ruminicola。Ruminobacter amylophilus 是目前已知分泌蛋白酶活性最高的菌种之一，同时其还具有分解淀粉的能力。Ruminobacter amylophilus 的蛋白水解活性不受培养基中存在的各种氮源和其他营养素的抑制，但蛋白水解活性会随生长速率而变化[9]。研究显示，该菌的生长和蛋白酶活性没有氨基酸依赖性，但必须有氨氮的存在，王梦芝等[10]研究也证实，一定范围内较高的氨氮浓度能促进该菌的生长，并且在以羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕、鱼粉为蛋白质补充料的日粮中，豆粕饲料更有利于该菌的生长繁殖。

Prevotella 是瘤胃内丰度较高的种属，可占瘤胃细菌总数的19.7%[11]，Prevotella brevis、Prevotella bryantii、Prevotella ruminicola 等均属于普雷沃氏菌科，Prevotella 在瘤胃内对蛋白质的水解起着关键的作用，Prevotella 的基因可能同时具有分泌纤维素酶和蛋白酶的作用，在不同比例的精粗日粮条件下反刍动物都会存在该菌的蛋白降解菌株，但不同物种间的蛋白水解活性具有很大差异，且一般难以从动物中分离出Prevotella 的蛋白降解菌株[12]。Ramsak 等[13]的研究表明87.8%的Prevotella 与已知的瘤胃Prevotella 的序列相似性小于97%，表明未被分离的普雷沃氏菌更为丰富并且在瘤胃微生物的测序结果中发现瘤胃Prevotella 和Bacteroides菌株表现出不同的遗传多样性。

在瘤胃内，除了主要的纤维降解菌外，大多数的瘤胃细菌都具有一定的蛋白酶活性，蛋白质降解过程中丁酸弧菌属中的Butyrivibrio fibrisolvens 和Proteoclasticus 发挥着重要的作用，在反刍动物瘤胃中具有较高的蛋白酶活性[14-16]。在瘤胃内Butyrivibrio fibrisolvens 和Proteoclasticus 的丰度约占总细菌的4.2%和4.0%[17]。但Reilly 等[18]观察到B. proteoclasticus 的浓度仅为2.01×106～3.12×107个/mL，相当于瘤胃细菌种群的0.3%，这极有可能是由于饲粮的不同和微生物DNA 提取方法的差异导致研究结果的不同。Butyrivibrio fibrisolvens 不仅参与蛋白质的降解过程，还参与纤维素的降解过程，在瘤胃内容物中发现的约75%的蛋白水解活性是与饲料颗粒而不是与瘤胃液体相关[19]，相关试验证明Butyrivibrio fibrisolvens 在体外和体内环境都可迅速附着饲料颗粒[20-21] 。当日粮中存在许多不易被降解类型的蛋白质时，该菌会大量繁殖，并且外源氨基酸或肽也可能影响蛋白水解活性。

Streptococcus bovis 具有胞外蛋白酶活性，Streptococcus bovis 对瘤胃蛋白质代谢至关重要，在多种蛋白存在的情况下具有较高的蛋白酶活性，并且其蛋白酶活性受可利用氮源的调节[22]。Belanche 等[23]研究显示，Streptococcus bovis 仅占瘤胃细菌DNA 的0.5%～1.6%，然而，较低丰度微生物也可以发挥较高的酶活性，Selenomonas ruminantium 和Ruminobacter amylophilus 都被认为是瘤胃微生物区系的一种高度蛋白降解菌[15，24]。

除以上瘤胃细菌外，还有一些蛋白水解活性较弱的细菌[25]，如Lachnospira multipara，这些微生物与瘤胃总蛋白水解能力有关，并且与高效率蛋白降解菌相互依赖。

2.2 多肽降解细菌

肽是蛋白质分解代谢过程中的中间产物，瘤胃内蛋白质经过水解形成的肽主要通过瘤胃微生物的作用降解为氨基酸，瘤胃微生物对肽的代谢具有一定的选择性，亲水性分子比疏水性化合物能更快地被利用[26]。

P. ruminicola 是瘤胃中主要的多肽降解细菌之一，其在纯培养中对Ala 3、Ala 4 和Ala 5 具有特异活性，是瘤胃肽分解中重要的微生物，然而P. ruminicola在体内肽水解中的优势必须在很大程度上取决于其高种群规模。Wallace 等[27]研究发现P. ruminicola M384 拥有四种蛋白质水解酶。Prevotella ruminicola B14 在瘤胃对蛋白质的降解和利用较为突出，其具有丰富的二肽酶活性，Griswold 等[28]研究发现P. ruminicola B14 更倾向于优先利用游离的肽和氨基酸，因此推测瘤胃内Prevotella 对肽降解的影响可能大于对瘤胃中蛋白质的影响。Bu. fibrisolvens 相对蛋白水解活性随菌株变化很大，Butyrivibrio C316具有半胱氨酸和金属蛋白酶性，而Butyrivibrio B21 菌株具有丝氨酸蛋白酶活性[16]。Streptococcus bovis 主要具有丝氨酸和半胱氨酸酶活性，此外其对亮氨酸对硝基苯胺（LPNA）具有高活性[15]。

2.3 脱氨细菌

瘤胃内中游离的氨基酸浓度通常较低，只有少量的氨基酸被直接用于微生物蛋白质的合成，大部分游离氨基酸被脱氨生成挥发性脂肪酸、氨、二氧化碳和甲烷。在反刍动物中，具有低氨产生率的优势细菌是瘤胃中的主要氨气产生者，同时还有一部分低丰度但具有高脱氨能力的细菌。瘤胃中主要的产氨细菌包括Butyrivibrio fibrisolvens、Prevotella ruminicola和Ruminococcus[29-30]，Ruminococcus 的脱氨能力差异较大，有些具有与高氨产生菌（HAB）相当的产氨能力。HAB 在瘤胃内的丰度较低占比12%左右，其较高的产氨率与瘤胃内氮素循环具有一定联系[31]。在反刍动物的氮经济中，瘤胃中氨产生的程度是需要考虑的重要因素。而氨的过量供应导致的瘤胃氮素利用低和氮损失过高，可能是HAB高度脱氨的结果。Paster等[32]和Attwood等[33]鉴定了Clostridium aminophilum为HAB，并且发现HAB无法直接利用蛋白质，必须依赖于蛋白质降解菌和肽类降解菌。

2.4 尿素分解菌

尿素和硝酸盐作为反刍动物饲粮的一部分，在瘤胃内可以被微生物快速降解，从而增加瘤胃内的氨含量[34]，而内源性尿素主要来源于瘤胃-肝脏循环并且通过唾液或瘤胃壁扩散进入瘤胃[7]。以上尿素对瘤胃内氨补充的途径在动物饲粮蛋白质水平低、氨限制的情况下具有重要作用[35]，但当反刍动物摄入正常蛋白质水平时，只有少数尿素分解的氨被微生物利用合成微生物蛋白，绝大部分的氨都以尿液和粪便的形式排泄到环境中[36]。早期研究中，Succinovibrio dextrinosolvens、Treponema sp.、Butyrivibrio sp.和Howardella ureilytica 被确认为尿素分解菌（UB）[37-38]。Jin 等[39]通过对细菌16S rRNA 基因测序和尿素酶C 基因富集分类测序，获得了UB在不同水平下的分类，在属水平上的Actinomyces、Pseudomonas、Neisseria、Haemophilus、Streptococcus和Bacillus；在科水平上的Succinivibrionaceae、Methylococcaceae、Clostridiaceae、Paenibacillaceae、Helicobacteraceae 和Methylophilaceae。UB 的尿素酶及其相关基因的活性受多种因素的调控[40]，如Ruminococcus albus 8 的尿素酶及其相关基因的活性受到NH3的调控而Succinivibrionaceae 和Bacillus 相较于其他UB对尿素更为敏感，在添加尿素的情况下，其丰度更高。

在反刍动物中，氮素利用菌主要在瘤胃内发生作用，瘤胃是饲料消化的主要部位，瘤胃系统由厌氧细菌、纤毛虫原生动物、厌氧真菌和古生菌组成，负责降解和发酵70%～75%的日粮化合物。动物健康和营养方面的生物技术进步在不断改善动物健康、生长和生产性能，特别是微生物制剂的使用[41]。微生物制剂被认为是宿主生物体通过维持微生物稳态和肠道健康的微生物，并且除了促进宿主生长之外，还具备替代抗生素的潜力，对动物健康具有重要意义。微生物制剂改善动物的生长性能通常与饲料摄入、营养物质消化率和瘤胃代谢相关，而氮素利用菌与反刍动物氮素利用相关的功能一般表现在乳产品中的蛋白含量增加、蛋白消化率提高、瘤胃氨氮浓度和微生物蛋白合成量的变化。如用Bacillus licheniformis 饲喂泌乳奶牛，降低了瘤胃内的氨氮浓度，并且提高了进入十二指肠的微生物蛋白含量，同时乳蛋白含量也显著增加。Jatkauskas 等[42]用Lactobacillus plantarum Milab 393、Pediococcus acidilactici P6、Pediococcus acidilactici P11、Eterococcus faecium M74、Lactococcus lactis SR3.54 的复合微生物制剂处理青贮饲料提高了奶牛瘤胃微生物蛋白的合成，试验期内瘤胃蛋白氮和总氮含量升高，而氨态氮的浓度在整个试验期内都较低。有研究者从韩国山羊瘤胃分离的一株真菌Orpinomyces strain KNGF-2 培养物灌注到成年绵羊瘤胃，发现菌株培养物增加了营养物质消化率和氮沉积率[43]。Prevotella bryantii 作为瘤胃中重要的氮素利用菌种，Chiquette 等[44]将其添加到奶牛日粮中，结果显示，添加Prevotella bryantii 日粮的奶牛其瘤胃发酵产物浓度更高，乳脂含量有增加的趋势，并且在瘤胃发酵过程中，蛋白水解活性及氨基酸脱氨活性增加。Mousa等[12]通过在犊牛日粮中添加具有分解蛋白质特性的Bacillus subtilis，观察其对犊牛生长性能的影响，结果显示，该制剂可以显著提高犊牛采食量、日增重和料肉比，并且可以显著提高日粮蛋白消化率。Erasmus等[45]研究表明，与对照组相比，酵母培养物处理组有较高的日增重，其原因可能是瘤胃微生物蛋白合成数量增加，饲料利用效率提高的结果。Sun 等[46]研究结果也表明，补饲Bacillus subtilis能增加瘤胃中蛋白水解细菌的数量。Nocek等[47]研究了一种Saccharomyces和Enterococcus Faecium的复合微生物菌剂对奶牛生产性能的影响，将这种制剂添加到奶牛的饲料中，结果发现，该制剂可以显著提高奶牛的乳量和乳蛋白含量。选择合适菌种进行青贮，也可以提高饲料利用率，在翁玉楠等[48]的试验结果中，添加Lactiplantibacillus plantarum 和Lentilactobacillus parabuchneri 进行饲料微贮可以提高青贮饲料粗蛋白含量，提高有氧稳定性。微生物制剂对反刍动物生长和氮素利用的影响见表2。

表2（续） 微生物制剂对反刍动物生长和氮素利用的影响

尽管相关微生物制剂在反刍动物生产中对提高氮利用效率的可行性已经被证实，但目前研究还处于初步阶段，需要进一步的研究来深入了解其应用效果和机制。

对瘤胃氮素利用菌的研究不仅有助于提高氮的利用率，还有助于微生物资源的开发利用。在当下低氮日粮的推广下，迫切需要制定新的行动方案，以实现反刍动物来源的食品生产的可持续增长，并改善动物的健康和福利。在反刍动物饲粮中添加微生物制剂可显著改善其生长、生产性能和整体健康状况。然而，然而，现在仍需要持续、深入、全面地体内研究，充分解读微生物对反刍动物的作用机制和作用，以及它们在改善动物健康和营养方面的作用，此外，菌株分泌的代谢物的特征及其在改善反刍动物健康和营养方面的作用也应进一步探索。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2024，45（16）：9-15

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