聚乙二醇化学修饰是将聚乙二醇高分子链化学偶联到蛋白质分子上，通过增大药物分子体积以有效延长其体内半衰期，同时遮蔽其免疫位点以显著降低免疫原性，是国际上公认的最为有效的长效蛋白质制剂化技术之一。
1. 聚乙二醇修饰的起源
什么样的大分子能够满足这一条件？Davis教授通过大量的文献调研, 把注意力聚焦在多糖类生物大分子上。一些多糖分子不仅水溶性好, 而且生物亲和性好, 不易引起免疫反应。但是, 多糖分子大都结构复杂, 反应位点太多, 很难做到反应产物的均一、可控, 而且文献上已经有前人进行了这方面的研究, 再去研究并不具备新颖性和创新性, 而且前人研究的结果也没有解决根本的问题。
一天, 他正在翻阅一本医疗期刊, 忽然发现一篇将聚乙二醇和聚丙二醇嵌段共聚物溶液输入人体血液的论文, 其目的是在器官手术中避免脂肪栓塞。这篇论文很有意思, 因为聚乙二醇和聚丙二醇在人们的印象中是化工产品, 和药物治疗几乎没有什么关系。但现在医生把它用于输液, 并且取得了初步的成功, 说明这种化合物的生物安全性。于是，Davis教授立即把着眼点放在聚乙二醇这一亲水性化合物上, 开始进行新的调研。随着调研的深入, 他对聚乙二醇分子越来越感兴趣。
聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种线型的高分子, 由环氧乙烷聚合而成。分子式简写为
其中n表示乙氧基单元的数量。PEG不仅溶解于水, 而且还溶解于一部分有机溶剂, 而当加入另一些有机溶剂时，又能从原来的溶液中沉淀出来。
和多糖不同, PEG只有末端的羟基可以活化并与蛋白质反应, 可以避免反应的复杂性和产物复杂性。但PEG也有两个羟基, 如果和蛋白质反应, 也可能形成不同交联程度的“PEG–蛋白质–PEG–蛋白质”的偶联物, 甚至可以出现沉淀。是否可以找到一种只有一个末端羟基的聚乙二醇？Davis教授又进行了调研。他翻阅了大量的文献, 没有结果; 他又查找化工厂的产品目录, 终于使他眼睛一亮: 在一个工厂的产品目录上有单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。mPEG和普通PEG的区别是, 一个末端为单甲氧基, 而另一个末端为羟基, 分子式为
对这个羟基进行活化引入活化基团并与蛋白质反应, 就只能在羟基末端形成PEG-蛋白质偶联物, 而不会形成交联物。教授迅速和该厂家联系, 获得了单甲氧基聚乙二醇。他从图书馆兴冲冲地赶回实验室, 带领他的学生开展了实验研究。
20世纪70年代, 是Davis教授课题组迅速崛起的时期。他们获得了美国国家科学基金会(NSF)的资助。实验取得了非常理想的结果, 证明经过PEG修饰以后, 牛血清白蛋白和牛肝过氧化氢酶在动物体内的免疫原性大大降低, 而且延长了其在体内的半衰期。随后, 更多的蛋白质被他们用于PEG修饰, 全都显示了免疫原性下降、体内半衰期增加的结果。他们在国际期刊J. Biological Chem.上连续发表的学术论文, 引起了学术界的重视。
1977年, Davis教授申请了美国发明专利, 内容为聚乙二醇或聚丙二醇修饰蛋白质和多肽, 所用的聚乙二醇或聚丙二醇的分子量范围为500~20 000, 修饰产物在注射到动物体内后没有免疫原性。
1983年, Davis教授的博士毕业生Abuchowski找到了投资方, 建立了国际上第一个把聚乙二醇修饰技术作为主营的生物技术公司Enzon公司。经过一段坎坷的产业化道路，Enzon公司已经成为国际著名的聚乙二醇修饰技术公司, 已有十几个药物先后上市或处于临床阶段, 总资产达到六亿美元。
2. 聚乙二醇修饰带来的益处
对蛋白质进行化学修饰的历史已经很长了。从研究蛋白质结构开始, 生物化学家就采用各种化学方法对蛋白质的氨基酸侧链基团如巯基、氨基、咪唑基、胍基、吲哚基进行修饰, 连接各种化学基团考察蛋白质结构和功能的变化。因此, 当Davis教授PEG修饰蛋白质的研究内容发表后, 并没有在生物化学界引起多大的反响。而且当对酶进行修饰以后, 测得的催化活性都下降, 甚至很大。从这点出发, 有人对PEG修饰持否定的态度。尽管修饰可以降低蛋白质的免疫原性, 但生物活性的大幅度下降使得研究者常常放弃了进一步的探索。然而, 当人们将修饰后的蛋白质输入动物, 测量其体内生物活性时, 却发现体内的生物活性出乎意外地高, 而且持续很长时间。这个发现使生物技术公司振奋了, 因为他们可以借助这项技术发展长效的基因工程蛋白质药物。体外活性低, 体内活性高, 成为PEG修饰蛋白质的普遍现象, 也是很多人之前没有想到的。
通过进一步研究发现, 体内活性的提升与PEG的分子量相关: 分子量增加通常能够增加体内的药物半衰期(或半寿期), 由此促进了聚乙二醇生产企业去合成更高分子量的mPEG, 从1万增加到2万、3万甚至4万。分枝化的PEG也被合成出来, 并表现出比相同分子量的直线型PEG更好的延长体内半衰期的作用。到目前为止, 上市的聚乙二醇修饰蛋白质药物都比原药的半衰期提高几倍以上, 使用药由原来的每天1针改为每周1针, 极大地方便了患者, 同时也提高了药效。例如聚乙二醇修饰干扰素用于治疗丙肝, 其效果就优于未修饰的干扰素。因此聚乙二醇修饰从原来的克服免疫原性的初衷, 已经发展为延长药效、提高治疗效果的主要手段。
3. 聚乙二醇修饰是否安全
PEG修饰药物是否安全？经常有人问这样的问题。虽然这项技术已经有30多年的历史, 药物上市也已20多年, 但像任何药物一样, 从严谨、科学的角度出发都不能回答说“没问题”。一种药物的副作用, 特别是隐匿的、长期使用的副作用, 常常需要经过许多年后才知道。目前可以说的是, 现在还没有关于PEG修饰药物出现重大事故的报道, 但人们, 特别是医药领域的专家们, 都在关注、研究这些药物可能出现的副作用。
聚乙二醇(PEG)作为医用辅料有更长的历史。早期美国FDA批准的人血丙种球蛋白冻干粉制剂中就有PEG作为配方之一。不过这里添加的PEG是双端为羟基的聚乙二醇, 也就是常规的PEG。关于常规的PEG, 20世纪40年代就有人做过动物安全性试验(Smyth et al., 1947), 并对其代谢进行了探讨(Schaffer et al., 1950)。试验表明, 分子量较小, 例如只有几百的PEG, 有一定的肾毒性; 当分子量大于1000以后, 毒性不够明显，例如分子量1450、3350、6000的PEG对兔子静脉注射给药, 总剂量高达10g/kg, 没有发现动物有毒性反应。关于代谢的试验表明, 肾排除是低分子量PEG从体内被清除的主要方式, 随着分子量增加, 粪便排除亦是从体内清除的一种方式。
由于单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和PEG极为相像, 仅仅是末端一个羟基被替换, 因此人们最初从早年PEG动物试验数据推论mPEG也具有生物安全性。也有文章表明分子量4万mPEG修饰的干扰素是通过肝脏代谢(Modi et al., 2000)经粪便排出体外的。但是近年来已有研究发现, mPEG修饰的蛋白质药物会引起机体产生对PEG的抗体, 从而加速了药物的清除。这种抗体的产生可能与其末端的单甲氧基有关(Armstrong et al., 2007; Sherman et al., 2012)。到目前为止, PEG抗体的发现还仅限于所报道的PEG修饰蛋白质药物如尿酸氧化酶, 在某种程度上影响了药效, 但是否会产生对人体的负面影响则需要进一步的研究。
4. 聚乙二醇修饰的前景
关于其药物副作用或潜在问题的研究, 标志着PEG修饰药物技术及其应用正在走向稳定和成熟。如今, 几乎所有的生物制药公司都有人在研究PEG修饰技术: 从PEG修饰延伸到其他修饰, 如白蛋白修饰、脂肪酸修饰、多糖修饰等。
作为生物修饰技术最典型、最受重视、已取得巨大经济效益且在某些疾病治疗如丙型肝炎上作用突出的代表, 聚乙二醇修饰仍然是我们研制新药、去除药物副作用、提升已有药物疗效的重要方法。
本文由刘四旦摘编自马光辉、苏志国等编著《聚乙二醇修饰药物: 概念、设计和应用》一书“写在前面——关于聚乙二醇修饰”，有删减改动，标题为编者所加。
ISBN 978-7-03-047265-6
《聚乙二醇修饰药物: 概念、设计和应用》由来自中国科学院、吉林大学、北京林业大学等国家著名研究机构和大学的多位专家共同撰写。作者基于20多年从事聚乙二醇修饰蛋白质研究、教学的经验和国内外相关研究的最新进展，对蛋白质的聚乙二醇化学修饰研究领域相关内容进行了较为全面的探讨和阐述，并重点对定点修饰进行了探讨。全书共分为七章，包括：单甲氧基聚乙二醇的合成、单甲氧基聚乙二醇的活化、聚乙二醇修饰蛋白质的反应控制、聚乙二醇-蛋白质偶联物的分离纯化、聚乙二醇-生物大分子偶联物的分析与质量鉴定、聚乙二醇化药物的药代动力学和PEG修饰长效药物。
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