中文摘要
目的 开发抗NF-κB受体激活蛋白配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）单克隆抗体（单抗）的纯化工艺。
方法 采用深层过滤澄清上游细胞培养液去除细胞，澄清后的培养液经过亲和层析捕获、低pH病毒灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析、除病毒过滤、超滤浓缩、透析置换、除菌过滤等步骤，获得单抗原液。通过收率和产品相关杂质去除情况评价亲和层析纯化效果，通过监测穿透点计算填料的动态载量（dynamic binding capacity，DBC）；通过考察不同的pH和温度条件对样品的纯度和活性影响，确定低pH病毒灭活条件；通过考察目的蛋白在不同缓冲体系下的稳定性、工艺相关杂质去除情况，确定合适的阴离子交换层析缓冲体系并考察纯化效果和DBC；通过线性洗脱，分段收集考察杂质情况确定阳离子交换层析工艺参数；通过处理量、通量、流量衰减确定病毒滤器的型号；根据浓缩、透析及过滤除菌说明书和平台技术确定滤膜孔径、进液流速和跨膜压力，再根据确定的参数进行浓缩及透析置换；最后经0.2 μm膜除菌过滤获得原液，并检测纯度和杂质。
结果 以MabSelect SuRe为亲和层析填料，DBC 45.3 mg/mL填料，25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸（pH7.5）为平衡液，150 mmol/L醋酸（pH2.8）为洗脱液；pH3.5灭活1 h；以Sepharose QFF为阴离子填料，最大DBC 60 mg/mL填料，50 mmol/L Tris-醋酸（pH7.5）为平衡液；SP HP为阳离子填料，上样量21.9 mg/mL，100%缓冲液A（10 mmol/L柠檬酸，pH5.5）—100%缓冲液B（10 mmol/L柠檬酸+1 mol/L NaCl，pH5.5）线性洗脱20柱体积；以Viresolve Pro为除病毒过滤器；采用PLCTK 30 kDa超滤膜包（C流道）超滤透析浓缩至（40.00±5.00） mg/mL，并以等体积方式10倍体积置换成原液缓冲液后除菌过滤；单抗纯度和杂质含量均符合质量标准。
结论 成功开发出抗RANKL单抗的纯化工艺，产品符合要求。
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正文
单克隆抗体（单抗）药物因其高特异性和靶向性，已成为治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的重要工具。随着生物技术的快速发展，抗体药物的研发与生产日益受到关注，纯化工艺作为抗体生产的关键环节，直接影响产品的质量、安全性和生产效率。抗NF-κB受体激活蛋白（receptor activator of NF-κB，RANK）配体（RANK ligand，RANKL）单抗通过抑制RANKL与RANK的结合，阻断破骨细胞的活化和分化，在骨质疏松症和骨相关疾病的治疗中临床效果显著。
抗RANKL抗体的复杂结构和功能特性对其纯化工艺提出了更高的要求，如何高效去除宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）、核酸、聚体及病毒等杂质，同时保持抗体的活性和稳定性，是工艺开发中的核心挑战。目前，单抗的纯化通常采用多步层析技术，包括亲和层析、离子交换层析和疏水相互作用层析等。尽管已有多种平台化工艺可供参考，但特定抗体的纯化仍需根据其理化性质和杂质谱进行个性化优化。
本研究旨在开发高效、稳定的抗RANKL单抗纯化工艺，通过系统优化各步骤的关键参数，包括亲和层析填料的选择、低pH灭活条件的确定、离子交换层析缓冲体系的筛选以及除病毒过滤器的性能评估等，最终获得符合质量要求的抗体原液。研究不仅可为抗RANKL抗体的生产提供可靠的技术路线，也可为其他单抗的纯化工艺开发提供借鉴，为抗体药物的工业化生产和临床应用奠定基础。
1
材料与方法
1.1
材料
抗RANKL单抗（R抗体）基因由珠海市丽珠单抗生物技术有限公司自主设计并构建，通过基因工程将目的基因转染至中国仓鼠卵巢细胞，经过克隆筛选后获得单克隆细胞培养表达，收取细胞培养液。
三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三水醋酸钠、冰醋酸、氢氧化钠、氯化钠均购自美国J.T.Baker公司，均为分析纯；分析纯山梨醇购自德国默克公司；注射级聚山梨酯20购自法国Seppic公司；对照药Prolia（原研药）购自美国Amgen公司。
亲和层析填料MabSelect SuRe〔柱体积（column volume，CV）1.0 mL〕、MabSelect SuRe LX（CV 4.7 mL）均购自美国GE公司，Minichrom Column Eshmuno A（CV 5.0 mL）购自美国Merck公司，Amsphere Protein A Column JWT 203CE（CV 5.0 mL）购自日本JSR Life Sciences公司。阴离子交换层析填料Sepharose Q FF（CV 4.7 mL）和阳离子交换层析填料SP HP（CV 1.0 mL）均购自美国GE公司。
除病毒滤器信息见表1。PLCTK 30 kDa系列超滤膜包（C型流道，复合再生纤维素材质，截留孔径30 kDa），购自美国Millipore公司，货号P3C030C05，面积0.5 m2，上样载量为240~360 g/m2。Sartopore 2系列除菌滤器（聚醚砜材质，孔径0.45 μm+0.2 μm），购自德国赛多利斯公司，货号5445307H7--SS--A，面积500 cm2，上样载量＜206 L/m2。
1.2
亲和层析工艺开发
分别用市场上4款耐碱亲和层析填料（1.1节）进行亲和层析，比较填料的动态载量（dynamic binding capacity，DBC）和纯化效果。
1.2.1 DBC的测定和比较 以相同保留时间（6 min）用4款填料分别上样，设定穿透点（流穿液中目的物浓度达到进样浓度一定比例时）约为5%，计算公式：DBC=（上样蛋白总量－穿透点前流出蛋白总量）/CV。
1.2.2 纯化效果的比较 分别使用不同填料，按70% DBC上样R抗体进行亲和层析，比较纯化效果。考察以下指标：收率=收集液中蛋白总量/上样蛋白总量；产品相关杂质（聚体和降解片段）通过分子排阻色谱-高效液相色谱（size exclusion chromatography-high performance liquid chromato-graphy，SEC-HPLC）、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳（non-reduced capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate，nrCE-SDS）、成像毛细管等电聚焦电泳（imaged capillary isoelectric focusing，icIEF）检测；工艺相关杂质（HCP、脱落的亲和层析填料配基蛋白质A）通过ELISA检测；宿主DNA通过实时荧光定量PCR检测。
按下面步骤进行层析。用25 mmol/L Tris-盐酸（pH7.5）平衡1个CV；以保留时间6 min上样；依次用25 mmol/L Tris-盐酸、0.5 mol/L磷酸钾（pH6.0）、25 mmol/L Tris-盐酸冲洗，分别平衡3个CV；用150 mmol/L醋酸（pH2.8）洗脱4个CV；用0.1 mol/L NaOH冲洗柱床再生，保留时间15 min；用4个CV的25 mmol/L Tris-盐酸冲洗柱床再平衡。
1.3
低pH病毒灭活条件的确定
将亲和层析收集液分别在pH3.4、3.5、3.6条件下孵育30、60、90 min，检测SEC-HPLC纯度、nrCE-SDS纯度、icIEF酸性峰含量、时间分辨荧光共振能量转移（time-resolved fluorescence resonance energy transfer，TR-FRET）活性等指标，考察对R抗体质量的影响，确定低pH病毒灭活工艺。
1.4
阴离子交换层析工艺开发
以Sepharose Q FF为阴离子交换层析填料，纯化低pH灭活后的R抗体，测定DBC，比较2种平衡液（20 mmol/L 磷酸缓冲液 pH7.0和50 mmol/L Tris-醋酸pH7.5），首先考察蛋白的稳定性，其次考察纯化效果（工艺相关杂质水平）。
1.4.1 样品稳定性比较 用1 mol/L Tris溶液将样品（浓度12.57 mg/mL）pH分别调至与2种平衡液相同，置于室温（25 ℃），将未调pH（pH5.5）样品置于相同条件下作为对照，分别在第1、4、8天考察SEC-HPLC单体、聚体和降解物，nrCE-SDS纯度，icIEF主峰和酸性峰。
1.4.2 纯化效果 按照表2程序进行样品纯化，比较2种缓冲液纯化后样品的收率和工艺相关杂质（HCP、蛋白质A、DNA）水平。
1.4.3 填料DBC的测定 在温度23.2 ℃、浓度4.64 mg/mL样品中加1 mol/L Tris溶液和纯化水调至pH7.5，电导率2.94 mS/cm，用50 mmol/L Tris-醋酸1 mL/min平衡1个CV；1 mL/min上样；用1.0 mol/L NaCl 1 mL/min冲洗3个CV再生；用0.5 mol/L NaCl 1 mL/min冲洗3个CV清洗，完成纯化。过程中取样检测工艺相关杂质去除情况，确定DBC。
1.5
阳离子交换层析工艺开发
使用SP HP填料以线性洗脱方式纯化阴离子层析收集的R抗体。根据平台化经验和产品说明书选用缓冲液A（10 mmol/L柠檬酸，pH5.5）和缓冲液B（10 mmol/L柠檬酸、1 mol/L NaCl，pH5.5），洗脱参数：100%缓冲液A—100%缓冲液B，20 CV；保留时间：4.7 min；进样量：21.9 mg/mL填料。分别收集洗脱峰，检测单体、聚体、降解片段和纯度，考察电荷异质性、HCP、DNA、蛋白质A等，分析产品质量及收率。
1.6
除病毒过滤工艺开发
阳离子纯化收集液蛋白浓度为10.94 mg/mL，使用3款除病毒滤器（每款滤器前对应1款预过滤器）分别进行过滤。设定工艺时长3 h，考察：工艺时间内处理量、通量、流量衰减（与初始滤速相比）等，选择最优的过滤器。
1.7
浓缩/透析和除菌
通过参考膜包说明书、公司平台工艺，确定进液流速为5~6 L/（min·m2），跨膜压力为（0.8±0.3）×105 Pa，其中入口压力（1.2±0.3）×105 Pa，回流端压力（0.5±0.3）×105 Pa。按照确定的参数先浓缩抗体至（40.00±5.00） mg/mL，再以等体积置换方式用10倍料液体积置换成原液缓冲液，最后经0.2 μm膜除菌过滤，获得R抗体原液。
2
结果
2.1
亲和层析
2.1.1 DBC 由表3可见，亲和层析填料MabSelect SuRe LX的DBC最高（57.2 mg/mL填料），其次为Eshmuno A和Amsphere Protein A，MabSelect SuRe的DBC最低。
2.1.2 纯化效果 由表4可见，4种填料纯化收率（低pH灭活前）从高到低顺序为：Amsphere Protein A＞MabSelect SuRe LX ＞Eshmuno A＞MabSelect SuRe。
4种填料纯化后的样品，SEC-HPLC单体含量均在96%以上，nrCE-SDS纯度均在87%以上，纯化效果无明显差异；Amsphere Protein A的HCP残留最高，其他3种填料无明显差异；DNA残留无明显差异，MabSelect SuRe LX和MabSelect SuRe的蛋白质A残留无明显差异。
综合分析，4种填料的纯化效果无明显差异，收率范围都可以接受，而MabSelect SuRe填料采购价格明显更低，即具有性价比优势，最终选择MabSelect SuRe作为本品亲和层析填料。
2.2
低pH病毒灭活
图1的结果显示，pH3.4~3.6条件下，在90 min之内，SEC-HPLC单体含量均在98.5%~100.0%（聚体小于1.5%），nrCE-SDS纯度均在91.3%~92.0%（片段在8.0%~8.7%），icIEF主峰含量均在73%~76%，TR-FRET活性（ELISA）均在105%~112%，无明显差异，即pH3.4~3.6均可作为病毒灭活条件。
2.3
阴离子交换层析
2.3.1 不同缓冲液中样品稳定性 从SEC-HPLC结果（图2）可知：pH值的增加对聚体形成影响不大，pH7.0和pH7.5条件下稳定性优于pH5.5；从nrCE-SDS检测结果（图3）可知：在3种pH条件下R抗体降解差别不大；从icIEF检测结果（图4）可知：放置4.8 d，pH值升高时酸性峰比例虽略有增加，但pH7.0和pH7.5之间无明显差异。
综上，R抗体在20 mmol/L 磷酸缓冲液和50 mmol/L Tris-醋酸缓冲液中稳定性无明显差异。
2.3.2 纯化效果
2.3.2.1 收率 实验1和2的收率分别为93.86%、93.53%，二者无明显差异。
2.3.2.2 工艺相关杂质残留水平 在pH7.5条件下，工艺相关杂质HCP、蛋白质A、DNA残留纯化后与纯化前之比（分别为4.3×10-3、0.065、2.93×10-4）均低于pH7.0条件下（分别为6.4×10-3、0.208、3.69×10-4）。
2.3.3 DBC 综合稳定性和纯化效果，选用50 mmol/L Tris-醋酸作为R抗体项目阴离子交换层析步骤平衡液。因蛋白质A含量较低且在合格范围内，所以不再检测蛋白质A残留。由表5可见，DBC超过69 mg/mL填料后，DNA、HCP残留量开始显著增加，以69 mg/mL填料为该步骤最大上样DBC，为留出安全空间（系数1.15），确定阴离子交换层析最大上样量为60 mg/mL填料。
2.4
阳离子交换层析
如图5所示，根据洗脱峰形将其分为3个组分（从前向后： SP HP 1-1、SP HP 1-2、SP HP 1-3）收集，分别进行检测分析。
由表6可见，SEC-HPLC结果显示，SP HP纯化后聚体减少；聚体和片段都主要分布在洗脱峰末尾；NR CE-SDS检测发现，线性洗脱的3个组分中都有降解（大小为完整抗体的一半），比例依次增加，表明峰尾有较多半抗体。
羧肽酶B酶切前后，主要组分SP HP 1-1的主峰比例高于Prolia；洗脱峰尾的酸、碱性峰比例高，见表7。
工艺相关杂质方面，SP HP纯化后，主峰HCP、蛋白质A都减少，洗脱峰尾HCP、蛋白质A、DNA杂质都较多，见表8。
综上，高分辨率阳离子填料SP HP可用于R抗体的精纯，通过线性盐梯度洗脱和分段切峰收集，可有效去除产品相关杂质（聚体、片段和碱性峰）和工艺相关杂质（HCP、蛋白质A、DNA），最终工艺收集SP HP 1-1段较纯组分收率可达76%。
2.5
除病毒过滤器选型
实际工艺时间约为170 min，由表9可见，在该工艺时间内，Viresolve Pro处理量最大，Virosart HF和SV4的分别为其56.88%和12.33%；Viresolve Pro通量也最大，Virosart HF和SV4的分别为其57.20%和11.25%；Viresolve Pro流量衰减相对较快（14.70%），SV4和Virosart HF基本没有衰减。综合上述技术指标和成本，最终选择Millipore公司的Viresolve Pro作为R抗体项目除病毒过滤器。
2.6
超滤、透析及除菌过滤后原液的结果
按照确定的参数执行工艺操作，在中试规模下，获得了纯度和杂质含量符合企业预定标准的R抗体原液，各项结果见表10。
3
讨论
本研究成功开发了抗RANKL单抗的纯化工艺，涵盖从细胞培养液澄清到最终抗体原液制备的全过程。通过系统优化各工艺步骤，包括亲和层析、低pH病毒灭活、离子交换层析、除病毒过滤和超滤透析等，最终获得了高纯度、高收率且符合质量要求的抗体原液。以下对各工艺步骤的开发结果进行讨论。
亲和层析作为单抗纯化的核心步骤，其填料的DBC和纯化效果直接影响最终产品的质量和收率。蛋白质A亲和层析虽以高选择性和载量成为抗体捕获的首选方法，但其成本较高且可能引入配基脱落等问题。本研究比较了4种蛋白质A亲和层析填料（MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、Eshmuno A和Amsphere Protein A）的性能。结果表明，MabSelect SuRe LX虽DBC最高（57.2 mg/mL填料），但其纯化后的HCP残留较高；而MabSelect SuRe虽然DBC较低（45.3 mg/mL填料），但纯化效果更优，HCP和DNA残留较低，且产品相关杂质（如聚体和片段）较少。选择MabSelect SuRe作为亲和层析填料，能够在保证产品质量的同时兼顾工艺的经济性。
低pH病毒灭活是单抗纯化工艺中不可或缺的步骤，主要用于灭活脂包膜病毒。本研究考察了不同pH值（3.4~3.6）和孵育时间（30~90 min）对R抗体质量的影响，SEC-HPLC、icIEF和TR-FRET等检测结果表明，低pH处理后的抗体单体含量、电荷异质性和活性均保持稳定。pH3.5、60 min的灭活条件被确定为最佳工艺参数。
阴离子交换层析主要用于去除工艺相关杂质（如HCP、DNA和蛋白质A残留）。本研究比较了2种平衡液的纯化效果，发现50 mmol/L Tris-醋酸在HCP和DNA去除方面表现更优。DBC结果表明，50 mmol/L Tris-醋酸的最大上样载量为60 mg/mL填料，能够有效控制杂质残留。选择50 mmo/L Tris-醋酸作为阴离子交换层析的平衡液，能够在不影响收率的前提下，显著提高纯化效果。
阳离子交换层析作为精纯步骤，主要用于去除产品相关杂质（如聚体、片段和电荷异质体）以及残留的工艺相关杂质。本研究采用SP HP填料进行线性盐梯度洗脱，结果显示，通过分段收集洗脱峰，能够有效去除聚体和酸性峰，同时显著降低HCP和DNA残留。主峰组分的收率达到76%以上，且单体含量高达99.7%，表明SP HP填料在R抗体精纯中具有优异的性能。
除病毒过滤是确保抗体药物安全性的关键步骤。本研究比较了Millipore Viresolve Pro、Sartorius Virosart HF和Pall SV4这3款滤器的性能。结果显示，Viresolve Pro在处理量、通量和流量衰减方面表现最优，能够在170 min内完成1 365 L/m²的过滤量。选择Viresolve Pro作为除病毒过滤器，能够满足大规模生产的需要。
超滤透析用于将抗体浓缩至目标浓度并完成缓冲液置换。本研究参考平台工艺，确定了进液流速5~6 L/（min·m2）和跨膜压力（0.8±0.3）×105 Pa等关键参数。使用Millipore PLCTK 30 kDa超滤膜包，成功将抗体浓缩至（40.00±5.00） mg/mL，并以等体积置换方式完成缓冲液置换，再经过除菌过滤获得原液。
尽管本研究成功开发了抗RANKL单抗的纯化工艺，但在实际生产中仍需进一步优化，如可以探索新型亲和层析填料或混合模式层析技术，以进一步提高纯化效率和产品质量。随着连续生产工艺的发展，未来可以考虑将部分步骤整合为连续操作，以进一步提高生产效率和降低成本。总之，本研究为抗RANKL单抗的纯化工艺开发提供了系统的技术路线和实验依据，为抗体药物的开发提供了参考。
作者
冉永梅1,2 赵永强2 许方岩2 郭春1
1沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016；2珠海市丽珠单抗生物技术有限公司研发部，珠海 519045
通信作者：
郭春，Email：chunguo@syphu.edu.cn
赵永强，Email：yq_008008@126.com
引用本文：冉永梅, 赵永强, 许方岩, 等. 抗RANKL单克隆抗体纯化工艺的开发 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(5): 301-308.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250211-00011
《国际生物制品学杂志》为中华医学会系列杂志，创刊于1978年10月，目前由中华人民共和国国家卫生健康委员会主管、中华医学会和上海生物制品研究所有限责任公司主办。现任主编李秀玲，编委团队共50人，审稿专家116人。
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