本文标题为《Circulating microbiome DNA as biomarkers for early diagnosis and recurrence of lung cancer》由 Haiming Chen、Yi Ma、Juqing Xu等作者共同撰写，本文首次系统探究循环微生物组DNA（cmDNA）在肺癌中的特征及应用价值，通过对 血浆样本进行全基因组测序，识别出肺癌患者与健康人群间差异富集的微生物物种，构建基于 cmDNA 的肺癌诊断模型和术后复发预测模型。其中诊断模型在独立验证集中AUC达93.2%，对 I 期肺癌和直径<1cm 肿瘤的检测灵敏度分别为 86.5%和87.1%；复发预测模型在测试集中AUC为80.9%，可有效区分术后复发高风险人群，为肺癌早期筛查和预后评估提供了全新的非侵入性生物标志物方案，同时建立了癌症液体活检的新范式。
01 摘要
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，晚期诊断和术后复发是导致其高死亡率的关键因素。现有筛查方法如低剂量计算机断层扫描（LDCT）存在假阳性率高、辐射暴露等局限，且缺乏精准的非侵入性生物标志物用于早期诊断和复发预测。本研究旨在探究循环微生物组 DNA（cmDNA）作为肺癌早期诊断和术后复发预测生物标志物的可行性，共纳入416名参与者，分为肺癌诊断队列和术后复发队列，对血浆游离DNA进行全基因组测序，去除人类序列后分析cmDNA特征。结果显示，肺癌患者的cmDNA谱与健康人群存在显著差异，具体表现为微生物多样性降低，变形菌门等类群（taxa）富集；基于119个差异物种构建的随机森林诊断模型，在合并验证集中AUC达93.2%、灵敏度87.7%，对早期和微小肿瘤具有优异检测能力；此外，基于术前cmDNA 特征构建的复发预测模型，可有效区分术后3年内复发与未复发患者，训练集AUC 88.1%、测试集AUC 80.9%，且预测分数是无复发生存期的独立影响因素。本研究证实 cmDNA 在肺癌中存在特征性改变，为肺癌早期诊断和复发预测提供了新型非侵入性生物标志物，拓展了癌症液体活检的研究范式。
02 研究背景
肺癌作为全球第二大常见癌症，其5年生存率与诊断分期高度相关，早期患者生存率超90%，晚期却不足5%。然而，超 80% 患者确诊时已处晚期，导致死亡率居高不下。主流筛查方法 LDCT虽能降低癌症相关死亡率，却因假阳性率高、辐射暴露和成本问题，难以大规模应用。此外，早期肺癌术后10%-50%患者会复发，多集中在术后3年内，目前缺乏有效复发预测工具。
微生物组与肿瘤发生发展密切相关，肺部微生物群落可调控肿瘤进程，不同病理类型肺癌微生物组成存在差异。cmDNA已在多种癌症检测中获初步验证，但肺癌领域的cmDNA早期检测和复发预测研究仍属空白，现有肺癌生物标志物也存在不足，亟需新型非侵入性标志物。
研究面临多重挑战：血浆中cmDNA含量极低，微生物序列仅占0.009%-0.012%，对检测技术要求极高；样本处理易受环境微生物污染，需严格去污染流程；个体生活方式等因素干扰微生物组，需精准队列匹配；早期肺癌和微小肿瘤的cmDNA特征差异细微，标志物筛选难度大。
03 模型设计
（一）总体思路
样本处理与测序：采集血浆样本，提取游离DNA，进行全基因组测序，去除人类序列后获得cmDNA数据。
差异特征筛选：比较肺癌患者与健康人群、术后复发与未复发患者的cmDNA谱，通过多样性分析、物种丰度比较、LEfSe 分析筛选差异富集的微生物taxa。
模型构建：基于差异微生物特征，采用随机森林算法构建诊断模型和复发预测模型。
模型验证：通过交叉验证、独立队列验证、低深度测序验证评估模型的稳定性和泛化能力。
临床价值分析：结合临床病理参数，分析模型预测结果与患者预后的相关性，验证其临床应用潜力。
（二）模型架构
肺癌诊断模型以通过LEfSe分析筛选的119个差异微生物物种（LDA>2.0，p<0.05）为输入特征，这些物种包括假单胞菌属、不动杆菌属等富集于肺癌患者的物种，以及镰刀菌属等富集于健康人群的物种，采用随机森林算法构建1000棵决策树，通过五折交叉验证优化模型参数，输出癌症预测分数并以0.511为临界值区分肺癌患者与健康人群；
术后复发预测模型则以复发与未复发患者间39个差异微生物类群为输入特征，涵盖候选纳米共生菌科、葡萄球菌属等富集于复发患者的物种，以及丙酸杆菌目、假单胞菌属等富集于未复发患者的物种，同样采用随机森林算法和5折交叉验证进行训练，输出复发预测分数并以0.347为临界值区分复发高风险与低风险人群。
（三）优化策略
去污染流程：通过阴性对照样本筛选潜在污染物，去除在阴性对照中相对丰度>5% 的物种；参考已有研究的污染物列表，排除已知污染taxa，确保模型特征的可靠性。
队列匹配设计：诊断队列中肺癌患者与健康人群按年龄、性别、吸烟状态进行匹配；复发队列中复发与未复发患者在年龄、性别、肿瘤直径、病理类型等临床参数上保持一致，减少混杂因素影响。
测序深度优化：采用53×平均测序深度构建模型，同时验证13×低深度测序数据的模型性能，在保证准确性的前提下降低检测成本，为临床转化提供可行性。
统计方法优化：采用Wilcoxon检验比较组间物种丰度差异，Adonis检验验证β多样性差异，Cox回归分析模型预测分数与预后的独立性，确保统计结果的严谨性。
（四）模型解释性
物种水平解析：借助LEfSe分析挖掘组间差异生物标志物，结合物种丰度热图可视化呈现群落结构特征，系统阐释模型中关键差异物种的生物学功能与生态意义。
多样性特征解释：肺癌患者cmDNA的Shannon多样性和Simpson多样性显著低于健康人群，与肠道微生物组在肺癌中的变化趋势一致，反映了肿瘤微环境对全身微生物组的调控作用。
临床相关性解释：复发预测模型的预测分数与患者无复发生存期显著相关，高风险人群复发风险显著升高，且该预测价值独立于TNM分期，说明cmDNA特征可补充现有临床分期系统的预后评估能力。
04 实验设置
本研究数据集涵盖肺癌诊断与术后复发两大队列。肺癌诊断队列含训练集（166 人，含69例肺癌患者与97名健康对照）、验证集 I（96人，48 例肺癌与48名对照）、验证集 II（53人，33 例肺癌与 20 名对照）及低深度验证集；术后复发队列纳入101名 T1期术后患者，按6:4分为训练（61 人）与测试集（40人）。
评估指标上，诊断模型采用AUC、灵敏度等核心指标；复发预测模型增加生存分析等；同时通过阴性对照、重复测序及低深度测序评估污染控制、可重复性与性能稳定性。
05 结果与分析
(一)肺癌患者与健康人群的 cmDNA 谱存在显著且稳定的差异特征。通过物种丰度分析、多样性比较证实，肺癌组微生物多样性（Shannon 指数、Simpson 指数）显著低于健康组，且在目、属、种多个分类水平均存在差异类群富集——假单胞菌目、不动杆菌属及假单胞菌属等物种在肺癌患者中丰度显著升高（p<0.001），而棒状杆菌目、镰刀菌属等在健康人群中更富集。
值得注意的是，这些差异特征在不同肿瘤大小（<1cm vs ≥1cm）和分期（I期vsII-IV期）患者中保持一致，未因肿瘤进展阶段出现明显波动，证实 cmDNA 改变具有肺癌特异性，为后续模型构建提供了稳定的特征基础。同时，基于Bray-Curtis距离的NMDS分析显示，肺癌组与健康组的cmDNA β多样性呈现显著分离（Adonis R²=0.027，p=0.001），进一步验证了两组微生物组成结构的本质差异。
(二)基于差异cmDNA特征构建的肺癌诊断模型表现出优异的检测性能。模型以 119 个差异物种为输入，在训练集中AUC达95.6%（95% CI：93.0%-98.3%），灵敏度 81.2%、特异性 90.7%；针对微小肿瘤（直径 < 1cm）的检测能力尤为突出，5 折交叉验证中 AUC 达 91.5%，与较大肿瘤（≥1cm）的 94.0% 接近，解决了早期肺癌检测灵敏度不足的痛点。
在多中心独立验证中，模型性能持续稳定：验证集I（以 I 期肺癌为主）AUC 92.1%、灵敏度 87.5%，验证集II（III-IV 期肺癌）AUC 97.2%、灵敏度 87.9%，合并验证集AUC最终达93.2%（95% CI：89.2%-97.2%）、灵敏度87.7%、特异性79.4%。更重要的是，模型在低深度测序场景下仍保持可靠性，即使测序深度降至1×，肺癌患者与健康人群的癌症预测分数仍能有效区分，为临床大规模低成本筛查提供了可行性。
(三)术前cmDNA 特征构建的复发预测模型展现出良好的预后评估价值。该模型基于39个复发相关差异类群训练，在训练集中AUC 达 88.1%（95% CI：79.7%-96.6%），灵敏度72.7%、特异性84.6%，在独立测试集中 AUC 仍保持80.9%（95%CI：66.6%-95.3%）。
通过模型预测分数划分的高风险与低风险人群，无复发生存期存在显著差异：高风险组术后3年复发率显著升高，Kaplan-Meier生存曲线显示两组差异具有统计学意义（p<0.001）。进一步分析发现，甲基杆菌科是预测复发的关键特征，其丰度高的患者无复发生存期显著缩短（p<0.001），且模型预测分数是无复发生存期的独立影响因素（HR=27.8，p=0.001），可补充现有TNM分期的预后评估能力，为临床制定个体化辅助治疗方案提供参考。
06 结论
本研究通过对416名参与者的血浆样本进行系统分析，首次证实循环微生物组 DNA（cmDNA）在肺癌中存在特征性改变，为肺癌早期诊断和术后复发预测提供了新型非侵入性生物标志物。研究发现，肺癌患者的cmDNA 谱与健康人群显著不同，表现为微生物多样性降低，假单胞菌目、不动杆菌属等类群富集，且这些差异在不同肿瘤大小和分期中保持稳定；基于 119个差异物种构建的随机森林诊断模型，显著优于现有部分生物标志物，且在低深度测序下仍保持稳定性能；同时，基于术前cmDNA特征构建的复发预测模型，可有效区分术后3年内复发与未复发患者。此外，研究还证实cmDNA与肿瘤内微生物组成存在一定关联性，且通过严格的污染控制和队列匹配确保了结果的可靠性。综上，本研究不仅拓展了对肺癌微生物组特征的认知，还为肺癌早期筛查和预后评估提供了实用的非侵入性检测方案，推动了癌症液体活检领域的发展，为后续多组学联合检测和临床转化研究奠定了基础。
07 论文评价
✅方法创新亮点
填补了肺癌领域cmDNA 系统研究的空白：此前cmDNA研究多集中于结直肠癌、肝癌等癌症，且多聚焦诊断层面，本研究首次同时覆盖肺癌早期诊断和复发预测两大临床需求，构建了双模型体系，不仅识别出肺癌特异性的 cmDNA 特征，还证实其预后价值，拓展了癌症液体活检的研究范式，为其他癌症的cmDNA研究提供了参考框架。
研究设计严谨且临床实用性强：研究纳入多中心、大样本量，分为训练集、多个验证集和测试集，且严格匹配年龄、性别、吸烟史等临床参数，减少混杂因素影响，还建立了从样本处理、测序分析到污染控制的完整流程，通过阴性对照、重复测序验证结果可靠性，同时探索了低深度测序下的模型性能，在保证准确性的前提下降低检测成本，为临床大规模应用提供了可行性，解决了现有液体活检技术成本高、难以普及的问题。
具有明确的生物学意义和临床价值：研究不仅量化cmDNA在肺癌中的特征性改变，还通过与肿瘤内微生物组的关联分析、关键物种的预后验证，揭示了cmDNA与肺癌发生发展的潜在机制，如假单胞菌目富集与不良预后的关联，为后续机制研究提供了方向；同时，诊断模型对早期和微小肿瘤的高灵敏度，可解决肺癌早期漏诊问题，复发模型的独立预后价值可辅助临床制定个体化治疗方案，切实满足临床需求，具有重要的转化应用前景。
⚠方法不足
论文的不足主要体现以下方面：一是诊断模型的特异性仍有提升空间，合并验证集中特异性为79.4%，对于大规模人群筛查而言，假阳性率可能偏高，需进一步优化模型或结合多组学提升特异性；二是复发预测模型缺乏独立外部验证，由于样本量限制，仅在内部测试集中验证，未纳入其他中心的独立队列，模型的泛化能力需进一步验证。
08 参考资料
Article:
10.1016/j.xcrm.2024.101499
图文：李洪
