中国科学院上海高等研究院
CRISPR-Cas系统是细菌抵御病毒的一种免疫系统。在CRISPR-Cas系统中，CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的简称，CRISPR经转录产生的RNA序列（被称作crRNA）可识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）的简称，crRNA引导的Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割入侵病毒的DNA或者RNA，从而防御病毒感染。
图1 CRISPR-Cas9示意图，源自网络
CRISPR-Cas系统划分为两大类，六种不同类型，第一大类包括类型I、III、IV，CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能;第二大类包括类型II、V和VI，由单个效应蛋白(如Cas9, Cpf1, C2c1、Cas13a(也称为C2c2) 等)来发挥功能。目前，链球菌Cas9 (SpyCas9)系统已被风暴般地应用于全世界范围内的生物医学研究以及基因治疗领域，进行细胞、组织或个体内DNA 的敲除、激活、修饰、突变等，而且该系统已经成为目前最重要的，也是最广泛使用的基因编辑工具。
面对细菌的免疫系统（CRISPR-Cas），噬菌体也相应进化出了自己的防御系统（Anti-CRISPR）。CRISPR-Cas9系统经常会发生脱靶效应，导致科学家们不想要的结果。而新发现的CRISPR-Cas13a似乎具有更强的特异性，或许有助克服这一点。
中科院生物物理所和哈工大相关研究组在上海光源和蛋白质设施晶体学线站的大力支持与配合下，在该领域研究取得了重要进展。
1）CRISPR-Cpf1基因编辑系统的分子机制
2016年，哈工大黄志伟教授团队通过结构生物学和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1识别crRNA以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子机制。这对认识细菌如何通过CRISPR系统抵抗病毒入侵的分子机理具有十分重要的科学意义，而且为成功改造Cpf1系统，使之成为特异的、高效的全新基因编辑系统提供了结构基础，让人们可以更加高效地对目的基因进行“关闭”“恢复”和“切换”等精准“手术”，使战胜癌症和艾滋病等疾病成为可能。
图2 CRISPR-Cpf1 结合crRNA 的复合物晶体结构
2） 解析VI型CRISPR-Cas系统C2c2-RNA复合物结构
2015年，一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-Ⅵ型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为C2c2。而后的研究进一步发现，Ⅵ型CRISPR-Cas系统是一种新型靶向RNA的CRISPR系统，而C2c2是一种以RNA为导向靶向和降解RNA的核酸内切酶，有望被开发作为RNA研究的工具，扩展CRISPR系统在基因编辑方面的运用。
2017年，中科院生物物理所王艳丽课题组解析了Ⅵ型CRISPR-Cas系统的效应蛋白C2c2与crRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构。crRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化，这种变化很可能会稳定crRNA的结合，进而对识别靶标RNA起着重要作用。该研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶标RNA的分子机制，对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统，为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础，有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。
图3 LshC2c2-crRNA 的二元复合物的晶体结构
3） 结构上揭示Cas13a切割RNA机制
Cas13a（也称C2c2）是第二大类VI型系统中的效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白。
2017年，王艳丽课题组和章新政课题组成功解析出来自口腔纤毛菌(Leptotrichia buccalis)的Cas13a(以下称LbuCas13a)结合到crRNA和它的靶RNA上时的晶体结构，以及LbuCas13a-crRNA复合物的冷冻电镜结构。
他们证实crRNA-靶RNA双链结合到LbuCas13a中的核酸酶叶(nuclease lobe, NUC)的一种带正电荷的中心通道内，而且一旦结合靶RNA，LbuCas13a和crRNA经历显著的构象变化。这种crRNA-靶RNA双链形成促进LbuCas13a的HEPN1结 构域移向HEPN2结构域，从而激活LbuCas13a的HEPN催化位点，随后LbuCas13a就以一种非特异性的方式切割单链靶RNA和其他的RNA。
这些发现揭示出VI型CRISPR-Cas系统的Cas13a抵抗RNA噬菌体的作用机制，这就为将它作为一种RNA操纵工具加以应用铺平道路，如将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。
图4 LbuCas13a-crRNA-target RNA 的三元复合物结构
4) Anti-CRISPR蛋白抑制SpyCas9活性的分子机制
SpyCas9系统是当下最重要、也是最广泛使用的基因编辑工具，但SpyCas9的脱靶效应也让科学家头疼。2017年首次发现了Listeria monocytogenes噬菌体来源的四个Anti-CRISPR蛋白，AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 和AcrIIA4。研究发现AcrIIA2和AcrIIA4蛋白在细胞内能够抑制SpyCas9的基因编辑活性。然而这些Anti-CRISPR 基因抑制SpyCas9 活性的分子机制并不清楚。
图5 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构
2017年，黄志伟课题组解析了SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构，揭示了anti-CRISPR 蛋白AcrIIA4 抑制SpyCas9 活性的分子机制。不仅对揭示细菌免疫系统(CRISPR-Cas9)与噬菌体防御系统(anti-CRISPR) “军备竞赛”的共进化分子机制具有重要的科学意义，而且为设计时间、空间特异性地，或条件性地精确控制SpyCas9基因编辑活性的工具提供了结构基础。
2018年，王艳丽课题组成功解析了Anti-CRISPR 蛋白AcrIIA2 与 SpyCas9蛋白及single-guide RNA (sgRNA) 的三元复合物3.3 埃的晶体结构，并结合体内和体外的功能实验，系统地阐述了噬菌体运用Anti-CRISPR 蛋白防御CRISPR-SpyCas9系统的分子机制。为控制或终止SpyCas9活性提供了新的参考和思路。有望将Anti-CRISPR 蛋白开发成新的基因编辑终止工具，实现精准基因编辑。
图6 AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA三元复合物的晶体结构
5) 揭示III型CRISPR-Cas系统免疫机制
在此之前，科学家们已经系统研究过 I 型、II 型、V 型和VI 型CRISPR-Cas 系统。而对最古老、最复杂的III 型CRISPR-Cas 系统，人类的了解还相对欠缺。III型CRISPR-Cas系统中的A亚型具有一个名为Csm的效应复合物。这一效应复合物的组装方式、识别“自我”与“非我”DNA，以及激活Csm1的DNA酶和腺苷酸环化酶的活性等分子机理，目前仍不清楚。
2018年，王艳丽课题组和章新政课题组解析了嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)III-A 型效应复合物Csm 的高分辨率晶体结构，以及 Csm 与不同类型的目的RNA 及ATP 的七种不同底物结合状态的、近原子分辨率的冷冻电镜结构，系统地阐述了III 型CRISPR-Cas 系统抵御外源核酸的分子机制。
该研究是CRISPR-Cas系统抗病毒机理的又一重大突破，进一步阐明多蛋白组成的效应复合物识别和切割外源核酸的分子机制，并为开发III 型CRISPR 系统作为应用工具打下重要的理论基础。
图7 III-A 型CRISPR-Cas 系统中Csm 复合物的结构生物学研究
X射线小角散射(Small-angel X-ray Scattering,SAXS),是发生在入射光束附近小角度范围内的X射线散射现象。其物理实质在于散射体和周围介质的电子云密度的差异。SAXS技术是检测物质微观结构的一项重要突破，是目前国际前沿领域“软物质”—纳米结构材料研究的强有力工具。
生物分子的X射线小角散射（Biological Small-angle X-ray Scat- tering, BioSAXS）是以生物分子作为研究对象的X射线小角散射技术。生物大分子（蛋白质和核酸）的尺度正好处于纳米尺度，是小角散射研究的重要领域之一。蛋白质科学研究上海设施BL19U2线站是国内首条专门用于生物样品的X射线小角散射研究的技术平台，在国内结构生物学领域具有相当重要的实际意义。
图8 生物小角X 射线散射线站BL19U2
1） 免标记顺磁核磁新方法的BioSAXS验证
“生命在于运动”是法国著名思想家伏尔泰提出的运动哲学格言。蛋白质作为生命组成的基本单元，其本身也是处于不断运动的动态过程中。作为生命活动的执行者，蛋白质只有通过运动才能执行特定的生物学功能。为了更好的了解蛋白质结构的动态变化过程，中科院武汉物理与数学研究所唐淳研究员率领其科研团队发展了一种免标记的顺磁核磁技术，不仅能够在接近生理环境的溶液状态下对蛋白质的动态结构进行解析，还避免了传统的顺磁核磁技术需要对蛋白质本身进行修饰标记的限制。
2016年12月19日，唐淳课题组的研究人员用这种新方法准确捕获了不同大小、不同运动特性的蛋白质体系在溶液中的动态系综结构，并借助国家蛋白质科学研究上海设施的BioSAXS 线站(BL19U2)对数据进行了验证。相关研究成果发表在《德国应用化学杂志》。该研究通过SAXS技术完美验证了课题组开发的顺磁核磁共振技术对蛋白质系综结构分布的标记，也进一步说明了SAXS与核磁共振两者的整合研究也将在其他领域发挥越来越重要的作用。
图9 SAXS 技术与溶液顺磁弛豫增强技术研究蛋白质动态结构应用实例
2） 荧光分子探针构建与应用的BioSAXS 验证
英国皇家化学会的《化学科学》(Chemical Sci-ence)刊物以封面形式报道了国家蛋白质科学研究上海设施BioSAXS 线站(BL19U2)用户在荧光分子探针构建与应用方面的研究进展。该工作由中科院药物研究所李佳研究员、藏奕研究院课题组与华东理工大学贺小鹏副研究员课题组合作，共同开发了一支可用于同时检测超分子交联蛋白质的新型糖基折叠型探针。这种探针采用两种常用的荧光染料，促使探针在水相中行程一类“自折叠”的染料折叠体，进而在荧光探针部分引入可被花生凝集素 (PNA)与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)识别的半乳糖，通过SAXS技术证实了这一折叠体可通过与PNA的相互作用解折叠，进而通过芘分子间堆叠作用形成探针/凝集素超分子交联体。这一发现可用于检测并协同调控生物大分子的结构，对于流行性病毒的快速检测具有重要意义。
图10 糖基折叠探针的结构、与蛋白质作用模式的SAXS 研究
同步辐射红外光源的亮度比传统的红外Globar光源高2~3个数量级，光谱范围覆盖近红外到远红外波段，同时它的聚焦性能、可调谐性能、时间结构、偏振性等都要优于传统红外光源。使用同步辐射傅里叶变换红外显微技术的高空间分辨可达衍射极限。
BL01B是上海光源第一条，也是目前为止唯一一条红外线站，包括红外显微谱学与成像实验站和时间分辨红外谱学实验站。红外显微谱学与成像实验站主要利用同步辐射红外光高亮度的特性来进行微小样品的显微与成像研究，时间分辨红外谱学实验站主要目标是利用同步辐射光可调的光子性能，用于高分辨的时间分辨傅里叶变换红外谱学研究。自2015年红外线站正式开放以来，BL01B红外线站已经应用在材料科学、环境科学、药物科学、细胞生物学和高压科学等领域，并取得诸多创新性成果。
1） 间充质干细胞早期分化研究
脂肪细胞分化是脂肪组织发展中的一个关键过程，脂肪发育异常有可能导致新陈代谢疾病，比如肥胖症、Ⅱ型糖尿病和异常血脂症。间充质干细胞是一种用来研究人类脂肪生成的理想体外模型。由于针对其早期分化过程研究不够充分，导致人们难以深入理解脂肪形成过程的机理。同步辐射红外光谱技术(SR-FTIR)能够检测细胞内的生物大分子及其变化信息。
上海应物所吕军鸿研究组借助BL01B线站，使用SR-FTIR技术研究了间充质干细胞的早期分化。SR-FTIR可以对间充质干细胞中主要生物大分子进行高分辨的无损红外检测，可以在单细胞水平上，根据间充质干细胞的光谱特征，判定它们在脂肪生成过程中所处的不同阶段。研究表明，在间充质干细胞决定阶段，脂质影响很大；SR-FTIR光谱中特征峰可以作为判断细胞早期分化阶段细胞状态的一个潜在的标志物。此研究再次证明，SR-FTIR是一种研究亚细胞标本的高灵敏方法，可用于研究细胞结构中的微小变化，也是研究干细胞命运决定和分化的有力手段。
图12 SR-FTIR 研究间充质干细胞（a）细胞的光学图像；（ b）红外光谱，标记出了生物大分子的吸收；（c）细胞中脂质、蛋白质和DNA 的分布
2） 髓鞘在中红外至太赫兹光谱范围传播信号的新机制
髓鞘是在许多脊椎动物神经系统中包裹神经细胞轴突的多层结构，最近有研究发现髓鞘的作用不只是作为神经的绝缘层，髓鞘对于认知和学习等过程都有重要作用。此外，髓鞘损伤还会导致各种疾病，如硬化症、瘫痪和认知障碍等。最重要的是，有髓鞘的神经中动作电位传播速度要远快于无髓鞘的神经，这种现象被称为跳跃式传导“saltatory conduction”，这种现象的机理仍不清楚。
国防科技创新研究院常超教授课题组采SR-FTIR技术，对有髓神经的神经结构进行了实验和理论研究。研究发现，在中红外到太赫兹光谱范围内，髓鞘的折射率比细胞外基质或轴突内高约2倍，说明髓鞘可以作为红外介质波导。通过计算髓鞘的材料特性与髓鞘神经中自由基能量分布的相关性，证明了具有正常厚度(约2μm)和介电常数的髓鞘鞘层可以约束鞘层内的红外场能，使红外信号在鞘层中传播，且没有大的能量损失。信号能量的传播在通过朗飞结时被周期性的“继电器效应”中继并放大。这些结果为解释红外和太赫兹通过神经髓鞘传递的机制提供了首个模型，同时可能促进生物组织无标记检测、基于生物材料的传感器、神经信息和无创脑机接口的发展。
图13 R-FTIR 研究髓鞘和轴突结构的红外折射性质
在上海光源运行开放前的十几年间，国内同步装置解析的蛋白质晶体结构只有99 个，上海光源运行开放十年后，解析的蛋白质晶体结构数达到了3775 个。全国结构生物学研究组从不足50个增到200多个。上海光源推动了我国结构生物学的跨越式发展。
图14 2013 年-2018 年上海光源生物大分子晶体学线站BL17U1 发表论文总数和RCR 与国际同类线站对比
中科富海作为中科院理化所大型低温技术成果转化而成立的产业化公司，已经实现了大型氦制冷机/液化器低温制冷装备的国产化，有效降低了国内大科学项目建设成本，为超导加速器、核聚变装置、超导强磁场、散裂中子源SNS、超导电力设备、探月工程、宇宙超低温环境模拟、氦气回收、液化和储运、氢气液化和储运等行业和业态提供了强有力的核心技术设备保障。
本文选自《现代物理知识》2019年第5期 花明摘编
