病原体检测新秀 — 基因“魔剪” Cas12a- 大数跨境

基因快讯

2020-08-04

导读：来自美国加州大学的 Charles Y. Chiu 及同事开发了一种基于 CRISPR-Cas12a（Cpf1）的快速检测 SARS-CoV-2 的方法，该方法被称为 SARS-CoV-2 病毒的

CRISPR/Cas 系统的发现引发了技术革命浪潮并产生了极大的社会影响。该系统是细菌进化出的一套专门针对噬菌体和外源性遗传物质的防御系统，用以抵御和清除入侵的异己遗传物质。CRISPR（规律性间隔的短回文序列重复簇）/Cas（CRISPR 相关蛋白）是细菌和古细菌获得性免疫所必需的。

『用 CRISPR/Cas 系统进行基因编辑』

CRISPR/Cas 系统（核酸酶和向导 RNA）的简单性，使该系统具有良好的实验室应用价值。基因组断裂处通过容易出现错配的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向重组（HDR）两种方式来激活修复过程。在提供有与目标基因座同源的供体模板的情况下，HDR 途径被激活，实现精准突变。在没有模板的情况下，NHEJ 被激活，导致插入或缺失（indels），从而改造目标区域，即进行基因编辑^（1,2）。Cas9 核酸酶的主要应用就在于此。

克隆自酿脓链球菌的 Cas9 核酸酶（A）和克隆自稻蝗科细菌 N2006 的 Lba Cas12a（B）的序列识别和 DNA 切割示意图

与大家熟知的 Cas9 酶类似，Cas12a 可用于编辑目标 DNA。该蛋白最初被称为 Cpf1^（3），由张锋团队在其 2015 年的 cell 论文中首次提出。Cas12a（Cpf1）是基因编辑酶家族的重要一员，它能够在 Cas9 不能作用的位置切割 DNA；同时，由于 Cas12a（Cpf1）切割 DNA 后产生黏性末端（即不规则的边缘），这使得在切割处插入新基因更为容易。EnGen^® Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶识别富含 T 的 TTTN PAM（protospacer adjacent motif）序列，为基因打靶开辟了新的基因组区域。所需 gRNA 短，仅 41-44 个碱基^（3）。其有两个核定位信号，提高运输到细胞核的效率。其切割产物带有 5’突出末端。该酶的活性温度区间为 16℃-48℃。与氨基酸球菌（Acidaminococcus）的同源酶相比，在更低温度下活性依然良好，能用于编辑冷血动物基因组，如斑马鱼和非洲爪蟾等。高浓度酶可用于显微注射、电转和脂质体转染。

『CRISPR/Cas12a（Cpf1）助力病原微生物

快速诊断』

但对于 Cas12a（Cpf1）来说，它能做的不止这些，一旦其与 crRNA 以及靶标 DNA 形成三元复合物，该复合物就会表现出很强的“乱切”活性，可将体系中非靶标单链 DNA 切成几个碱基长度的“碎片”^（4）。利用这一特性，Doudna 教授团队开发出一种被称为“DETECTR”（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的诊断系统，该系统由 CRISPR-Cas12a（Cpf1）和向导 RNA、荧光报告分子及 RPA（recombinase polymerase amplification）等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量 DNA 进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，RPA 扩增目标 DNA，使 Cas12a（Cpf1）更容易找到并切割它，然后激活 Cas12a（Cpf1）的核酸酶活性使其切割体系中的其它单链 DNA（也就是荧光报告分子），从而发出荧光^（5）。

DETECTR 技术原理示意图：Infographic by the Howard Hughes Medical Institute(CRISPR-based Technology Can Detect Viral DNA, https://www.hhmi.org)

来自美国加州大学的 Charles Y. Chiu 及同事开发了一种基于 CRISPR-Cas12a（Cpf1）的快速检测 SARS-CoV-2 的方法，该方法被称为 SARS-CoV-2 病毒的 DETECTR 系统。该方法使用环介导等温扩增 RT-LAMP 技术，对从鼻咽或口咽拭子中提取的 RNA 进行反转录和等温扩增，然后利用 Cas12a（Cpf1）检测设定的冠状病毒序列。^（6）

图片来源：James P. Broughton., et al (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. ⁽⁶⁾

以上种种都展示了 CRISPR Cas12a（Cpf1）用于核酸检测的实力。在不久的将来，除了基因编辑，期待 CRISPR 带给我们更多惊喜！

『参考文献』

Overballe-Petersen,S., et al(2013). Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA. Proc.Natl.Acad.Sci.
Gong,C., et al(2005). Mechanism of nonhomologous end-joining in mycobacteria: a low-fidelity repair system driven by Ku, ligase D and ligase C. Nat.Struct.Mol.Biol.
Zetsche,B., et al(2015). Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell.
Shi-Yuan Li, et al(2018). CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Research.
Janice S., et al(2018). CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science.
James P. Broughton., et al (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology.

『用 NEB EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)

(NEB #M0653)发表的近期文献』

James P. Broughton., et al (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology.
James P. Broughton., et al (2020). Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. Preprint at medRxiv.
Curti Lucia., et al(2020). An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. Preprint at BioRxiv.
Long T.Nguyen., et al(2020). Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection. Preprint at BioRxiv.
Xiong Ding., et al(2020). All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV virus. Preprint at BioRxiv.
Kenneth N., et al(2020). Integrated Micropillar Polydimethylsiloxane Accurate CRISPR Detection (IMPACT) System for Rapid Viral DNA Sensing. Preprint at BioRxiv.
Mengdi Bao., et al(2020). Magnetic Bead-Quantum Dot (MB-Qdot) CRISPR Assay for Instrument-Free Viral DNA Detection. Preprint at BioRxiv.

『基因编辑相关酶产品信息』

产品名称	货号	规格
EnGen^® Lba Cas12a （Cpf1）核酸酶	M0653S/T	400/2,000 pmol
其它基因编辑相关酶
EnGen^® Spy Cas9 核酸酶 NLS	M0646T/M	400/2,000 pmol
EnGen^® Spy Cas9 切刻酶	M0650S/T	400/700 pmol
EnGen^® Spy dCas9 （SNAP-tag^®）核酸酶	M0652S/T	400/700 pmol
EnGen^® Sau Cas9 核酸酶	M0654S/T	70/400 pmol
Cas9 核酸酶， S. pyogenes	M0386S/T/M	70/300/600 pmol
Tth Argonaute （TtAgo）蛋白	M0665S	50 pmol