一文带您了解DS3000 Compact CE Sequencer新系统对多种类试剂盒的兼容性

DS3000 Compact CE Sequencer系统升级后支持自定义用于分析的荧光染料和Size Standard Protocol，兼容更多种类的试剂盒。

为了验证新功能，本次试验使用旧型DS3000不支持的的荧光染料组合，运行SNaPshot™试剂盒(Thermo Fisher Scientific，一种基于引物延伸的SNP分析方法）。在本次实验中，将带您逐步了解如何完成实验方法的自定义设置，完整展示运行结果。

本次实验基于DS3000新系统，一次性检测了6个SNP。

1.1. 创建新的Dye Set

新型DS3000 (Instrument Software System Version:6138300-00或更高版本)可创建用于分析的荧光染料(Dye Set）。在本次实验中使用旧型DS3000不支持的Dye Set(DS-02, Applied Biosystems™）。此Dye Set(DS-02)由R110、R6G、TMR、ROX和LIZ™ 组成。

操作步骤如下：

①从主屏幕中依次选择New&Edit Protocols、Dye Set 和Create (图1A-C)。

②显示如图1D的New Dye Set界面。在该界面Dye Set ID处输入"DS-02"，在Application处选择Fragment, 在Dye Set Template处选择Custom Dye Template，其次设置Dye Condition。

③选择Edit将显示Edit Dye Condition(图1E)。

图1. 创建新的Dye Set

④Edit Dye Condition界面：

首先在Dye Color处，选择将用于Size Standard的荧光颜色。在SNaPshot™中选择Orange。

其次，设定用于分析的荧光染料。在Matrix Dyes和Sample Dyes中选择Matrix standard和用于测试样品的荧光染料。

最后，设定Spectral Calibration的条件。在Calibration Peak Order中指定检测Matrix standard的顺序。

SNaPshot™ 使用的Matrix standard是DS-02（Applied Biosystems™）。不需要更改Condition Number Upper Limit和Quality Value Lower Limit。

1.2. 创建新的Size Standard Protocol

从主屏幕中依次选择New&Edit Protocols，Size Standard Protocols(图2A)。显示Size Standard Protocol List时，选择Create(图2B)。在Size Standard中输入“LIZ 120(50 -120)”。

其次在Dye Color中选择Size standard的荧光颜色。在SNaPshot™使用的GeneScan™ LIZ™120（Applied Biosystems™）中，选择Orange。

其次选择Size Standard Definition,并在弹出的窗口中用“，”符号分隔输入GeneScan™ LIZ™120的尺寸(50、62、80、110、120、图2C）。依次选择OK，Save以保存设置(图2D)。建议输入大于等于50的碱基值。

图2.创建新的Size Standard Protocol

这是因为短碱基DNA分子的电泳速度不稳定，所以可能无法计算Electrophoresis Quality(EQ)和Sizing Quality(SQ)。根据上述设定，EQ与SQ的计算将排除碱基长度小于50的峰值波形。

1.3. 创建新的Sizecalling Protocol

从主屏幕中依次选择New&Edit Protocols，Sizecalling Protocols(图3A)。显示Sizecalling Protocol List时，选择Create(图3B)。将显示New Sizecalling Protocol。

以如下步骤输入每个选项卡的值(图3C-G）。

Protocol ID：LIZ120_sizecalling。

Size Standard：从下拉菜单中选择LIZ 120(50 -120)。

Analysis Range：选择Full。

Peak Amplitude：输入175 RFU。

Size Quality：“Fail”中输入0.995；“Pass”中输入0.997。Electrophoresis Quality：“Fail”中输入40；“Pass”中输入100。

选择Save以保存。

1.4. 创建新的Assay

从主屏幕中依次选择New&Edit Protocols，Assay(图4A)。显示Assay List时，选择Create(图4B)。显示New Assay。

以如下步骤输入每个项目的值(图4C)。

Protocol ID：输入SNaPshot_Polymer4。

Application：选择Fragment。

Polymer：选择Polymer 4。

Dye Set：选择DS-02。

Instrument Protocol：选择Fragment_Analysis 36_Polymer 4。

Analysis Protocol：选择LIZ 120_sizecalling。

选择Save。

图4.创建新的Assay

2.1. Matrix standard

2.1.1. 用49 μL Hi-Di™ formamide（Applied Biosystems™）稀释1 μL DS-02 Matrix Standard。

2.1.2. 每次注入10 μL的稀释溶液。

2.1.3. 将溶液在95 °C下热处理5分钟，之后将其在冰上快速冷却。

2.2. SNaPshot™ 样品

2.2.1. 使用SNaPshot™ Multiplex Kit(Applied Biosystems™)附带的标准DNA进行单碱基延伸反应(表1、2)。

2.2.2. 在反应溶液中加入碱性磷酸酶(1U)，在37 °C下反应1小时，之后将其在75 °C下处理15分钟。

2.2.3. 将溶液在95 °C下热处理3分钟，之后将其在冰上快速冷却。

3.1. Spectral Calibration

3.1.1. 从主屏幕中依次选择Calibration，Spectral Calibration(图5A-B)。

3.1.2. 从Dye Set List的Calibrated Date/Dye Set中选择Calibrated Date/Dye Set为DS-02,并且Polymer为Polymer 4(图5C)的行。

3.1.3. 按照屏幕的说明安装样品盒，实施Spectral Calibration。

3.2. 样品泳动

3.2.1. 从主屏幕中选择Fragm ent Analysis(图6A)。Run ID中输入任意字符串，之后选择Next。

3.2.2. 显示Setup the Strip。选择Next。

3.2.3. 显示Setup Strip Information。选择要分析的Lane(图6B)。

3.2.4. 显示Edit Strip Information。从1st Assay中选择SNaPshot_Polymer 4(图6C-D)。

3.2.5. 注册样品名称、样品类型，之后选择Link。

3.2.6. 按照屏幕上的提示开始电泳。

图6. 设置样品泳动

使用GeneMarker v3.0.1(SoftGenetics)分析获得的结果，并计算出每个峰的碱基长度。在每个基因座中检测到一或两条峰值波形。这些峰值分别表示纯合子和杂合子突变。杂合子突变是由单碱基单位相邻的峰值波形形成。检测两个峰值波形需要具有很高的分离性能的仪器。

DS3000毫无遗漏地检测到了杂合子的峰值波形(图7、SNP2和SNP5)。表3总结出与各种荧光色素相对应的碱基和反应产物的碱基长度。

图7. SNaPshot™反应产物的波形模式

波形数据是根据GeneMarker v 3.0.1的分析结果绘制的。

＊1：由于荧光染料在电泳中的移动速度不同，因此实际测量值可能与正确值不一致。

GeneMarker通过将每个峰的检测位置与Size Standard进行比较，计算出组成每个峰的DNA分子的碱基长度。将实测的碱基长度与正确的碱基长度相对应，可以判断已检测到本次解析对象的所有4个纯合子和2个杂合子。